Kurkime ateitį drauge!

Prof. Vida Mildažienė, Dr. Zita Naučienė.

Proteomika – naujausias genomikos veidas  

 

Spartus mokslinių tyrimų technologijų tobulėjimas padėjo nuskaityti visą žmogaus ir kitų organizmų genomą. Esamos tyrimų technologijos ir DNR bei baltymų savybės (pvz., stabilumas) lėme tai, kad DNR buvo tarsi “žemiau kabantis vaisius”, t.y., DNR tyrimai santykinai lengvesni už baltymų tyrimus:

l  Molekulinės biologijos tyrimai visada buvo daugiau orientuoti į genus, tik vėliau buvo domimasi  jų koduojamais baltymais.

l  DNR yra labai stabili molekulė, sudaryta iš 4 nukleotidų. Erdvinė molekulės konformacija (dviguba spiralė) ir funkcijos pobūdis nepriklauso nuo nukleotidų sekos.

l  Istoriškai ankstesni baltymų tyrimai apsiribojo vienos rūšies baltymo analize (baltymų chemija) ir savybių tyrimu.

l  Baltymų įvairovė yra daug didesnė, o stabilumas – mažesnis.

 

Tai lėmė didesnius laimėjimus nustatant žemesniųjų organizmų ir žmogaus genomą:

l  1970- bakteriofago, 1981 – mtDNR, 1995 - nustatyta visas bakterijos Haemophilus influenzae (1.8 mln bp) genomas;

l  1998 - 100Mb Caenorhabditis elegans genomo seka;

l  1999 – visa žmogaus 22 chromosomos nukleotidų seka;

l  2000 – beveik visas žmogaus genomas;

l  Tobulėja technologijos –  D. melanogaster genomas sekvenuotas per 6 savaites

 

1 pav. Įvairių organizmų rūšių genomų sekoskaitos chronologija

 

Publikavus visą žmogaus genomo seką, 2001 metais triukšmingai ir pompastiškai paskelbta pogenominė tyrimų era –  mokslas pereina į naują etapą, kurio tikslas yra tik  išaiškinti visas genomo funkcijas. Žiniasklaida skelbė, kad perskaityta gyvenimo knyga, suprastas biologijos šventasis raštas ir pan.

Tačiau netrukus suvokta, kad „Gyvenimo knyga“ parašyta mums dar neįskaitoma  kalba, tarsi senoviniais hieroglifais.  Informacija apie DNR nukleotidų seką suteikia ganėtinai ribotą supratimą apie ląstelės vidinį gyvenimą. Pogenominė era atnešė daugiau klausimų nei atsakymų. Pradėta suvokti, kad DNR sekos nustatymas nereiškia, kad išaiškintas jos veikimas. Labai greitai po pogenominės eros paskelbimo ėmė kauptis faktai, kurie leido suprasti, kad mūsų žinios ir supratimas apie genomą yra dar labai menki:

l  Mažiau kaip 1,2 % genomo koduoja baltymus;

l  Tik pusės nustatytų genų funkcija yra žinoma; apie 40% nustatytų genomo sekų koduoja nežinomos funkcijos ar ne visai nustatytos funkcijos baltymus

l  <30% žmogaus genomo transkribuojama, t.y., nuskaitomos tarpgeninės sritys (miRNR);

l  97-98% žmogaus genomo transkriptų sudaro baltymų nekoduojanti RNR (ncRNA)

l  Individualių žmonių DNR skiriasi tik 0.2%, arba 1 iš 500 bazių;

l  98% žmogaus DNR  sutampa su šimpanzės DNR; 99 procentai pelės ir žmogaus genų sutampa (pelės ir žmonės turi po 30 000 genų, iš kurių tik apie 300 yra skirtingi. Abi rūšys turi “uodegos genų”,  tačiau suaugusių žmonių šie genai  “išjungti");

l  Paneigta dogma apie iRNR kiekio ląstelėje atitikimą baltymo kiekiui;

l  paneigta dogma apie organizmų sudėtingumo laipsnio priklausomybę nuo genų skaičiaus:

 

q  Viroidai                                  – 0-1 genai

q  RNR virusai                           – 1-25 genai;

q  T4 virusas                              – 200 genų;

q  Mycoplasma genitalium        – 350 genų;

q  E. Coli bakterija                     – 4000 genų;

q  Mielės                                     – 6000 genų;

q  Vaisinės muselės                     – 13000 genų;

q  Nematodos                              – 18000 genų;

q  Bitės                                        – 15000 genų

q  Arabidopsis                             – 26000 genų;

q  Žmonės                                   – 26000 genų;

q  Pelės                                        – 25000 genų;

q  Ryžiai                                      – 45000 genų

Kaip matome, aukštesniųjų eukariotų baltymus koduojančių genų skaičius (20,000 -30,000) panašus į   kirmėlių ar vaisinių muselių (apie 20,000), o tam tikrų augalų ir tam tikrų vienaląsčių protistų genomas didesnis už žmogaus.

Žinių apie visus organizmo genus nekanka suprasti kas lemia fenotipą. 2 pav. pavaizduotas vieno iš gražiausių Lietuvos drugių suaugėlis ir vikšras. Tai yra pavyzdys kaip tas pats genomas priklausomai nuo skirtingos baltymų raiškos lemia labai skirtingą fenotipą.

 

 

buterflybug

 

2 pav. Makaono drugio ir vikšro genotipas vienodas, o fenotipas labai skiriasi

 

Šiuo metu jau suvoktas nepaprastas biologinių sistemų sudėtingumo laipsnis. Suprasta, kad norint suprasti kaip realizuojamas genomas, svarbu atlikti visuminę organimo arba ląstelių baltymų analizę. Didžiajai daugumai ląstelės vyksmų tiesiogiai svarbūs ne genai, o jų koduojami baltymai. Siekiant suprasti ląstelės vyksmus, būtina gauti informaciją apie joje esančių baltymų visumą: baltymų struktūrą, funkcijas ir jų sąveiką.  Nustatyti genomo seką (raidžių tvarką) yra tik pradžios pabaiga. Genomika yra daug daugiau nei genomo sekos išaiškinimas, nes genomo realizavimui suprasti būtina proteomika.

Genomas realizuojamas per proteomą, tai – centrinė molekulinės biologijos dogma (3 pav.).

 

 

3 pav. Naujausi proteomikos ir genomikos atradimai suteikė naują prasmė pagrindinei molekulinės biologijos dogmai. Prasiplėtė žinios apie RNR funkcijas, baltymų konformacinę įvairovę ir struktūros ypatumus, daugiafunkciškumą

 

Baltymų visuminės analizės galimybės iš esmės prasiplėtė, pradėjus taikyti daug efektyvesnius DNR ir baltymų visuminio tyrimo metodus.  2002 m. chemijos mokslų Nobelio premija skirta J.B. Fenn (JAV) ir K. Tanaka (Japonija) už biologinių molekulių MS analizės metodo patobulinimus, įgalinančius atlikti baltymų tyrimus.  Šiuo metu sparčiai tobulėja baltymų skirstymo, jų sekos nustatymo ir identifikavimo metodai, vadinami proteomikos metodais. Dabartinis genominių tyrimų etapas vadinamas proteomika. Tai yra mokslas, įgalinantis tam tikru laiko momentu nustatyti visų ląstelės baltymų raišką, visas jų atmainas, modifikacijas, jų kiekybę, vietą ir funkciją ląstelėje, taip pat sąveikas su kitais baltymais ar kitomis molekulėmis. Tokie tyrimai buvo neįsivaizduojami, kol nebuvo ištobulinti masių spektrometrai ir bioinformatikos metodai.   

           

1994 m. Markas Vilkinsas (Marc Wilkins) pasiūlė terminą Proteoma – tam tikro organizmo (ląstelės) sintetinamų baltymų visuma tam tikru laiko momentu.

 

Proteomika yra  visų genomo koduojamų baltymų struktūros ir funkcijos nustatymas. Tai viso organizmo baltymų rinkinio analizė. Jos metu nustatoma baltymų ekspresija – jos kitimas organizmui vystantis ir sąveikaujant su aplinka. Proteomika tiria savitus ląstelės arba organizmo genų raiškos kitimus baltymų lygmenyje.

 

l  Atliekama ne tik baltymų kokybinė ir kiekybinė analizė. Nustatoma ir jų vieta ląstelėje, modifikacijos, sąveikos bei funkcijos; 

l  Proteomika yra genomikos dalis;

l  Proteomikos pradžia gali būti datuojama 1975 m., kai 2DE buvo pritaikyta visiems organizmo baltymams tirti (Klose ir O’Farrell).

l  Organizmas turi vieną genomą, tačiau daug proteomų

l  Organizmo baltymų skaičius gali būti keliomis eilėmis didesnis negu genų. Tai paaiškinama alternatyviu sukirpimu ir posttransliacinėmis modifikacijomis, kurių žinoma virš 200 atmainų.

l  Baltymai sudaryti iš >20 monomerų. Kiekvieno baltymo erdvinė struktūra (biologinės funkcijos pobūdis) yra unikali. Jie nestabilūs.

l  Proteoma labai dinamiška. Ji sąveikauja genomu ir kinta priklausomai nuo organizmo vystymosi, aplinkos poveikio ir ligų. Kiekvienas kūno organas turi kitą proteomą.

l  Vienas baltymas - daug funkcijų (“moonlightning”): skirtingos funkcijos dalijasi vienu genu.

Organizmo sudėtingumą lemia  ne genomo DNR kiekis ir ne jo koduojamų baltymų kiekis –  jį lemia nepaprastas baltymų pasaulio sudėtingumas.

 

Proteomikos tikslas yra išaiškinti baltymų visumos veikimo principus: baltymų raišką (kiek kokių baltymų yra tam tikroje ląstelėje), jų funkcijos valdymo principus, sąveiką, nutaikymą, veikimo vietas, įtaką medžiagų apykaitai ir struktūrai, fenotipui; proteomos pokyčių prasmę. Apibendrintai galima išskirti dvi proteomikos strategijas  (4 pav.):

I. Visuminis baltymų raiškos apibūdinimas - -   2DE/MS;

II. Visuminis baltymų funkcijų apibūdinimas. 

 

4 pav. Atsižvelgiant į pobūdį, proteomikos tyrimus sąlyginai galima padalinti  į strukūrinę ir funkcinę proteomiką. Siekiant suprasti kaip realizuojamas genomas (genai – biologija), reikia sukaupti visą įmanomą  informaciją apie baltymų veiklą ląstelėje.

 

Proteomikos tyrimų tipai

l  Struktūrinė proteomika - 2D ir 3D baltymų struktūra

l  rentgeno spindulių kristalografija;

l  NMR spektroskopija.

l  Raiškos proteomika - visuminės baltymų raiškos nustatymas, įvertintant jos pakitimus vystymosi, aplinkos poveikio ir susirgimų metu – svarbu diagnostikai, prognostikai ir vaistams kurti.

l  Baltymų sekos nustatymas ir identifikavimas;

l  Baltymų kiekio įvertinimas;

l  Elektroforezė, IEF, RP-HPLC, baltymų gardelės;

l  Masių spektrometrija.

l  Funkcinė proteomika (Cell mapping)

l  Baltymų modifikacijos, vieta ląstelėje, sąveikos, etc.

l  Masių spektrometrija,elektroforezė,  mielių dihibridinė sistema; baltymų (ligandų) gardelės, mutagenezė;

l  In silico (bioinformatika).

Šios metodų įvairovės taikymas leidžia apeiti akivaizdžiausias genomo funkcijos išaiškinimo problemas (5 pav.):

1)      Ne visi organizmo genomo genai tam tikru laiko momentu nuskaitomi, veikia labai sudėtingi daugialypiai ir iki galo neištirti genų raiškos valdymo mechanizmai;

2)       iRNR lygis nėra lygus ekspresuojamo baltymo lygiui, koreliacija tarp iRNR ir baltymo kiekio galioja tik taip vadinamiems gausiesiems baltymams, todėl ląstelės iRNR “profilis” tiesiogiai nesutampa su baltymų “profiliu”;

3)      Baltymų funkcijai svarbios jų posttransliacinės modifikacijos (PTM) , kurių jau yra žinoma daugiau kaip 300 atmainų;

4)      egzistuoja skirtingos konformacinės to paties baltymo būsenos;

5)      Siekiant įvertinti baltymų veiklą, būtinos žinios apie baltymų sąveikas.

 

5 pav. Proteomikos tyrimų sudėtingumą lemia genų raiškos ir funkcijos valdymo mechanizmai, kurie veikia transkripcijos, transliacijos ir potransliaciniame lygmenyje 

 

PTM nustatymo problemos

l  Mažas santykinis modifikuotų baltymų kiekis, lyginant su nemodifikuotais;

l  Būtina išskirti visus modifikaciją turinčius peptidus, nes galimos ne vienos vietos modifikacijos;

l  PTM yra laikinos ir grįžtamos, todėl būtina inaktyvinti jas šalinančius fermentus; 

l  PTM nėra stabilios, jų gali nelikti tyrimo metu.

 

6 pav. Baltymų posttransliacinių modifikacijų įtaka baltymų funkcijoms ląstelėje

 

Viena iš geriausiai ištirtų PTM yra baltymų fosforilinimas. Daugeliui iš jūsų yra žinoma, koks sudėtingas yra baltymų fosforilinimo irdefosforilinimo sistemų valdymas ir kokia svarbi jų funkcija. Pabandykime išvardinti dar dešimt modifikacijų – acetilinimas, oksidacija, glutationilinimas, acilinimas, ADP-ribozilinimas, ubikvitilinimas, O- ir N-glikozilinimas, nitrozilinimas, deamidinimas. Kaip matome 6 pav. vienas baltymas gali būti modifikuotas vienu metu keliais šių būdu, taigi ląstelėje yra vieno baltymo subpopuliacijos, kurių masė ir krūvis skiriasi, t.y. skirstant elektroforezės būdu vienas baltymas gali sudaryti atitinkamai daugybę dėmių.  

 

Apibendrinant, galima pateikti tokias proteomikos šakas (7 pav.):

l  Baltymų skirstymas.

l  Baltymų kokybinis nustatymas.

l  Baltymų kiekybinis nustatymas.

l  Baltymų sekos nustatymas. Susijęs su bioinformatika, funkcijos prognozavimu, evoliucinių ryšių įvertinimu.

l  Baltymų erdvinės struktūros nustatymas (struktūrinė proteomika).

l  Baltymų funkcijų tyrimas:

l  Interaktomika (baltymų sąveikos nustatymas ir prognozavimas).

l  Baltymų modifikacijos tyrimai (fosfoproteomika ir glikoproteomika).

l  Ląstelės proteomika – baltymų vietos ląstelėje nustatymas.

l  Eksperimentinė bioinformatika (Mathias Mann) – eksperimentinių ir bioinformatikos metodų derinys.

 

 

7 pav. Proteomikos metodų ir jų teikiamos informacijos visuminė schema

 

Baigiant, galima pajuokauti, kad baltymų pavadinimas kildinamas iš senovės graikų mitologijos personažo – dievo Proteus. Šis ypatingas dievas žinojęs apie praeitį, dabartį ir ateitį, tačiau vengdavęs apie tai kalbėti. Pagautas jis lengvai  ištrūkdavo, nes galėjo įgauti bet kokį pavidalą. Tokštamą atsakymą gaudavo tik sugebantys jį išlaikyti.  Dėl gebėjimo virsti kuo tik norėjo, Proteus tapo  pirmapradės medžiagos, iš kurios mes visi sudaryti, simboliu.

Proteomikos metodai atnešė labai daug naujos informacijos ir stipriai pakeitė požiūrį į biologinių sistemų sudėtingumo laipsnį, kurį lemia šio Proteus dievo vertos baltymų savybės.  Kai kurias iš šių naujienų plačiau aprašysime Biochemijai skirtai mokslo populiarinimo straipsnelių serijoje (pvz. netrukus pasirodys straipsneliai „Daugiadarbiai ir bestruktūriai baltymai“; „Posttransliacinės baltymų modifikacijos“).

Siekiant suprasti baltymų ir ląstelės pasaulio sudėtingumą, būtina taikyti adekvačius metodus, kurių visuma vadinama Sistemų biologija. Jį apima ir „sintezuoja“ visus genomikos ir proteomikos lygmenis (8 pav.): struktūrinė ir funkcinė genomika, transkriptomika, proteomika, metabolomika, interaktomika.

 

 

8 pav. Šiuolaikinė biologija yra vadinama sistemų biologija

 

Visų šių lygmenų informacija yra svarbi norint supranti, kaip veikia gyvosios sistemos, norint įminti gyvybės mįslę ir išmokti teisingai su ja elgtis.

 

 

 


Naturales Scientiae Omnibus