Kurkime ateitį drauge!

Kamieninė ląstelė: senos ir naujos tiesos

Virginija Bukelskienė

Biochemijos institutas, Vilnius

 

2007 m. Nobelio premija medicinos ir fiziologijos srityje paskirta M. R. Capecchi, O. Smithies ir serui M. J. Evans. Šie mokslininkai apdovanojimų nusipelnė už genetinių modifikacijų įvedimą į pelių organizmą, panaudojant embrionų kamienines ląsteles.

2005 m. prestižine A. Lasker premija, kuri dar vadinama “Amerikos Nobeliu”, už darbus identifikuojant kamienines ląsteles (“kraują formuojančius kolonijų vienetus”), kurie davė pradžią visiems šiuolaikiniams prenatalinio ir suaugusio organizmo kamieninių ląstelių tyrimams, buvo apdovanoti kanadiečiai mokslininkai E.A. McCulloch ir J. E. Till.

Šie du pasaulyje garbingiausi mokslo visuomenės apdovanojimai paskutiniaisiais metais  skirti už kamieninių ląstelių tyrimus. Kodėl šioms ląstelėms skiriamas toks didelis dėmesys?

Žinios apie kamienines ląsteles dažnai yra kontraversiškos, o jų gavimo ir panaudojimo perspektyvų aptarimas reikalauja specifinių bendrosios ir molekulinės biologijos, medicinos ir etikos žinių. Net atsakymas į klausimą “Kas yra kamieninė ląstelė?” nėra paprastas (McCulloch ir Till, 2005). Vienas iš klasikinių atsakymų teigia, kad kamieninė ląstelė - pirminė proliferuojanti (besidauginanti) nediferencijuota ląstelė, kuri yra išlaikiusi savybę specializuotis į kitų tipų ląsteles. Tačiau šis teiginys nėra visiškai tikslus, nes kamieninė ląstelė, be ląstelėms-pirmtakėms priskiriamos savybės diferencijuotis, pasižymi ir kita, unikalia, savybe – kai kurios iš dukterinių ląstelių išlaiko to paties diferenciacijos lygio kamieninei ląstelei būdingas savybes, tai yra, formuoja taip vadinamą save palaikančią populiaciją, tuo tarpu kitos dukterinės ląstelės gali pasukti diferenciacijos kryptimi. Kitaip sakant, vienos kamieninės ląstelės palikuonys (arba palikuonis) gali būti arba to paties diferenciacijos lygio ir formuoti save palaikančią populiaciją arba, priešingai, šią savybę prarasti ir pasukti diferenciacijos linkme, o vėliau ir dalyvauti formuojantis atskirų organų audiniams (Siminovitch ir kt., 1963). Kurios ląstelės kokia linkme pasuks, kas nulemia jų apsisprendimą? Egzistuoja ne viena šiuos reiškinius aiškinanti teorija, šia linkme dirba daug pasaulio mokslininkų.

Visos kamieninės ląstelės, atskaitos tašku laikant organizmo gimimą, skirstomos į dvi pagrindines grupes - prenatalinės kilmės (negimusio organizmo) kamieninės ląstelės ir po gimimo, paprastai vadinamos suaugusio organizmo (angl. adult stem cells) kamieninėmis ląstelėmis. Tikrosiomis embriono kamieninėmis (angl. embryonic stem cells) ląstelėmis vadinamos kelių dienų embriono (blastocistos vidinio sluoksnio) ląstelės. 

 

Istorija

            Kamieninių ląstelių tyrimo pradžia laikomas 1961 m. pasirodęs J.E. Till ir E.A. McCulloch staripsnis, kuriame aprašomi kolonijas formuojantys vienetai pelės kaulų čiulpuose (Till ir McCulloch, 1961). 1978 m. hematopoetinės kamieninės ląstelės aptiktos žmogaus virkštelėje (Prindull ir kt., 1978). Netrukus, 1981 metais, praėjusiųjų metų Nobelio premijos laureatas M. Evans su bendradarbiais, o nepriklausomai nuo jų ir G.R. Martin gavo pelės embrioninių kamieninių ląstelių kultūrą (Evans, 1981; Evans ir Kaufman, 1981; Martin, 1981).   Beje, G. Martin laikomas termino “embrioninė kamieninė ląstelė” autoriumi. Po to turėjo praeiti daugiau kaip 15 metų, kol Viskonsino universiteto (JAV) profesorius J.A. Thomson su kolegomis iš vidinio blastocistos sluoksnio išskyrė, pradėjo auginti kultūroje ir gavo pirminę beždžionės (1995 m.) ir žmogaus (1998 m.) embriono kamieninių ląstelių linijas. Beždžionės ląstelės kultūroje buvo diploidinės, turėjo normalų kariotipą, pasižymėjo polipotentinėmis savybėmis - diferencijavo į visų trijų gemalinių lapelių kilmės organizmo ląsteles (Thomson ir kt., 1995). Žmogaus embriono ląstelės kultūroje pergyveno daugelį persėjimų, išlaikė normalų kariotipą ir aukštą telomerazės aktyvumą, turėjo embrioninėms ląstelėms tipišką žymenų rinkinį (Thomson ir kt., 1998).

Tarp šių dviejų ypatingai svarbių kamieninių ląstelių tyrimo rezultatų chronologiškai įsiterpia trečiasis, ne mažiau svarbus – 1997 m. klonuota avytė Doli (Griffin ir Wilmut, 1997), o vėliau – ir kiti gyvūnai. Panašiu laiku (apie 1997-98 m.) užsimenama ir apie klonuotą žmogaus embrioną, kuris buvo auginamas iki 12 dienų amžiaus, 2001 m. pranešta, kad žmogaus embriono ląstelės buvo užaugintos iki 4-6 ląstelių stadijos (http://www.sciam.com/article.cfm?articleID=0008B8F9-AC62-1C75-9B81809EC588EF21&pageNumber=4&catID=4).

Apie 2000 m., mokslininkai įrodė, kad iš suaugusios pelės audinių galima išskirti ląsteles, kurios gali duoti pradžią skirtingų organizmo audinių tipų ląstelėms, pavyzdžiui, kaulų čiulpų ląstelės gali išsivystyti į nervų ar kepenų ląsteles ir pan. (Wulf ir kt., 2001). Šie atradimai buvo stulbinantys, jie teikė vilčių, kad kamieninių ląstelių diferenciaciją ir proliferaciją bus įmanoma kontroliuoti, o tai neabejotinai galėtų būti naudojama gydymui.

2004-2005 m. į kamieninių ląstelių tyrimo istoriją pateko ir korėjietis mokslininkas Hwang Woo-Suk, teigęs, kad embrioninių ląstelių liniją jis gavo iš neapvaisinto kiaušialąstės, tačiau vėliau paaiškėjo, kad šie teiginiai neatitiko tikrovės.

Greta bazinių mokslinių tyrimų ir toliau buvo ieškoma neįprastų, bet patogių kamieninių ląstelių šaltinių, kurių ląsteles būtų galima panaudoti atskirų organų audinių regeneravimui. Daug kartų žvilgsniai krypo į virkštelės kraują ir amniono skystį. Nemažai tyrimų atlikta, stengiantis virkštelės kraujo ląsteles nukreipti kepenų diferenciacijos linkme. Vienas iš pirmųjų tokių darbų paskelbtas 2002 m. (Danet ir kt., 2002), o praėjusiais metais šitokie tyrimai net buvo pavadinti alkoholiu piktnaudžiaujančių žmonių viltimi… Ne mažiau aktualu kamienines ląsteles kreipti ir kita linkme – į insuliną gaminančias ląsteles (Denner ir kt., 2007). Literatūroje randama daug kitokių bandymų, kurie parodė, kad yra galimybė tiek virkštelės kraujo, tiek ir amniono skysčio ląsteles diferencijuoti į visus 220 organizmo ląstelių rūšių tipus (http://www.boston.com/news/local/massachusetts/articles/2007/01/07/amniotic_fluid_yields_stem_cells_harvard_researchers_report/). Šitie darbai svarbūs dėl to, kad iš virkštelės ar amniono skysčio palyginti lengvai gaunamos kamieninės ląstelės gali būti naudojamos gydymui kaip altenatyva embriono ląstelėms, o atlikus tam tikras manipuliacijas su jomis, galima tikėtis ir diferencijuotų atskirų organų audinių ląstelių.

Praėjusiais metais paskelbti rezultatai apie dviejų primatų embrioninių kamieninių ląstelių linijas, gautas iš suaugusios Rhesus beždžionės fibroblastų (Byrne ir kt., 2007; Mitalipov ir kt., 2007). Panašūs darbai jau buvo atlikti su pelėmis, tačiau su beždžionių ląstelėmis tai vis nepasisiekdavo. Šiuo atveju kamieninės ląstelės gautos po manipuliacijų su odos ląstelių branduolio perkėlimu į apvaisintą beždžionės kiaušialąstę, iš kurios prieš tai buvo pašalintas branduolys. Susiformavus blastocistai, iš jos vidinio sluoksnio išskirtos ląstelės ir gautos jų linijos. Šių ląstelių DNR analizė patvirtino, kad jų branduolio DNR yra identiška donorinio organizmo somatinei ląstelei, o mitochondrijų DNR yra kilusi iš kiaušialąstės. Abiejų gautų linijų ląstelės morfologiškai nesiskyrė nuo normalių embrioninių ląstelių, jos turėjo pagrindinius embrioninių ląstelių žymenis, tiek in vitro, tiek ir in vivo diferencijavosi į visų tipų ląsteles. Jau šiais metais paskelbta, kad analogiškas darbas atliktas su žmogaus ląstelėmis – į apvaisintą žmogaus kiaušialąstę buvo persodintas fibroblasto branduolys, gauta blastocista, iš kurios išskirtos ląstelės ir gauta ląstelių linija (Frencha ir kt., 2008). Tokie darbai labai reikšmingi kuriant citoterapijos schemas, kur reikia embrioninių ląstelių.

2006-2007 m. dvi nepriklausomos grupės paskelbė panašius straipsnius apie pelės (Takahashi ir Yamanaka, 2006) ir žmogaus (Yu ir kt., 2007) suaugusio organizmo kamieninių ląstelių rediferenciaciją (arba dediferenciaciją). Šiuose straipsniuose įrodoma, kad kamieninių ląstelių vystymasis galimas ne tik specializacijos, bet ir priešinga kryptimi. Pagrindinis dėmesys skiriamas kamieninėms ląstelėms būdingiems transkripcijos faktoriams, įrodoma jų reikšmė „kamieniškumo“ išlaikymui. Pirmajame straipsnyje išvados grindžiamos tyrimais, atliktais su pelės embriono ląstelėmis ir suaugusios pelės fibroblastais. Į šias ląsteles įvedus transkripcijos faktorius Oct3/4, Sox2, c-Myc ir Klf4 buvo gautos taip vadinamos iPS (angl. induced pluripotent stem) ląstelės, kuriose buvo nuskaitomi embriono kamieninėms ląstelėms būdingų žymenų genai, šių ląstelių morfologinės savybės buvo tokios pat kaip ir embriono kamieninių ląstelių. Jas sušvirkštus po betimusinių Nude pelių (imunodeficitinės pelės, toleruojančios svetimus antigenus) oda, susiformavo navikai, kuriuose rastos visiems trims gemaliniams lapeliams būdingos diferenciacijos ląstelių (tai laikoma neabejotinu ląstelių kamieniškumo įrodymu). Dar daugiau, sušvirkštus šias ląsteles į pelės blastocistą - iPs ląstelės įsijungė į embriono vystymąsi. Antrajame straipsnyje panašūs tyrimai atlikti su žmogaus somatinėmis ląstelėmis, į kurias įvedus Oct4, Sox2, Nanog ir Lin28 transkripcijos faktorius gautos polipotentinės ląstelės, pasižyminčios visomis embrioninėms ląstelėms būdingomis savybėmis (pastoviu normaliu kariotipu, telomerazės aktyvumu, būdingais žymenimis, būdingais ekspresuojamais genais, diferenciacijos į visų trijų gemalinių lapelių ląsteles galimybėmis ir kt.). Šie atradimai ypač reikšmingi tuo požiūriu, nes duoda vilčių, jog polipotentines kamienines ląsteles bus galima gauti iš diferencijuotų ląstelių. O tai, neabejotinai, palengvintų daugelio bioetinių problemų sprendimą, tikintis kamienines ląsteles naudoti gydymui.

Jau šiais metais paskelbtas straipsnis apie žmogaus embriono kamienines ląsteles, gautas nepažeidžiant embriono (Chung ir kt., 2008).

 

Kamieninių ląstelių lemtis

Suaugusio organizmo audiniuose kamieninės ląstelės aptinkamos išsidėsčiusios tiek po vieną, tiek ir telkiniuose, savotiškose „nišose“, kur jas supa specifinė aplinka ir tokios pat kamieninės ląstelės. Tokių „nišų“ pavyzdžiais galima laikyti gemalines ląsteles, plauko maišelyje, kaulų čiulpuose, plonųjų žarnų gaurelių kriptose, smegenų specifinėse srityse aptinkamus kamieninių ląstelių telkinius (Fuchs ir kt., 2004). Tikėtina, kad šiuose telkiniuose esančių ląstelių likimą apsprendžia tiek jas supanti mikroaplinka, tiek ir už šios „nišos“ ribų esančios kaimyninės diferencijuotos ląstelės (1 pav.). Kaimyninės diferencijuotos ląstelės sekretuoja specifinius veiksnius ir sukuria ekstraląstelinę aplinką, kuri leidžia kamieninėms ląstelėms „nišoje“ vykdyti „savęs-atgaminimo“ programą ir, tuo pačiu, išlaikyti savybę, reikalui esant, vykdyti diferenciacijos programą.

Labai svarbūs ir fiziniai kontaktai tarp kamieninių ir jų kaimynių nekamieninių ląstelių, kurie taip pat įtakoja šių ląstelių kamieniškumo savybes ir jų buvimą „nišoje“. Dažnai tokiose „nišose“ ląstelės nesidaugina, jos yra taip vadinamoje ramybės būsenoje („tylinčios ląstelės“) arba dauginasi labai lėtai. Aktyvią šių ląstelių proliferaciją dažniausiai indukuoja tik nauji veiksniai, atsiradę dėl tam tikrų audinio pažeidimų, nors mechanizmai, lemiantys kamieninių „tylinčių“ ląstelių pažadinimą proliferacijai ar diferenciacijai nėra pilnai ištirti. Dar nėra pakankamai žinoma ir tai, kaip kiekvieno dalinimosi metu kamieninė ląstelė „renkasi“ savo kelią – likti to paties diferenciacijos lygio ir atgaminti savo populiaciją ar pasukti diferenciacijos linkme.

 

Text Box: 1 pav. Telkiniuose esančių kamieninių ląstelių likimą apsprendžiantys veiksniai.  „Nišoje“ ląsteles supanti aplinka palaiko jas nediferencijuotoje būsenoje, bet jei ląstelė iš jos išeina, ją pradeda įtakoti kaimyninės diferencijuotos ląstelės, kurios ir ją nukreipia diferenciacijos linkme. Kamieninių ląstelių pusiausvyrą tarp ramybės būsenos, save palaikančio dalinimosi ir nukreipimo diferenciacijos linkme įtakoja sekretuojami ekstraląsteliniai veiksniai, kurie inicijuoja viduląstelinio signalo perdavimo kaskadą ir aktyvina tam tikrus būtinus transkripcijos faktorius. 
Manoma, kad ta pati diferencijuotų ląstelių ekstraląstelinė aplinka didele dalimi lemia kamieninių ląstelių neišėjimą iš „nišos“. Taigi, šių ląstelių likimas priklauso nuo jų sugebėjimo integruoti išorinius ir vidinius signalus, „sprendimui“ įtaką daro ir ląstelių buvimo vieta bei laikas.
Adaptuota pagal Paratore ir Sommer, 2006.

 

 

Iki šiol nėra iki galo aišku, ir kokie veiksniai lemia ląstelių „kamieniškumą“. Tikėtina, kad šiame procese dalyvauja keli ląstelės signaliniai keliai, tarp kurių dažniausiai minimi Wnt, Notch, transformuojančio augimo faktoriaus β (TGFβ), kaulų morfogeninio baltymo (BMP), leukozę inhibuojančio veiksnio (LIF) signalo perdavimas. Analizuojant genų raišką, ieškant tokių, kurių ekspresija galėtų būti būdinga kamieninėms ląstelėms, sukaupta informacija nėra gausi, o ir turimos žinios yra gana prieštaringos. Iki šiol nustatyti tik keli genai, kurių raiška registruota visose kamieninėse ląstelėse. Manoma, kad tokia informacija atspindi egzistuojančius esminius vidinius skirtumus tarp atskirų tipų kamieninių ląstelių. Juk kaip tik vidiniai ląstelės ypatumai apsprendžia, kaip kamieninė ląstelė interpretuoja iš ją supančios aplinkos ateinančius labai įvairius signalus. Taigi, kamienininės ląstelės likimas priklauso nuo daugybės įvairių veiksnių kombinuoto veikimo, kuris pasireiškia per kelis skirtingus signalinių kelių tinklus. Šių tinklų išraiška yra labai dinamiška, besikeičianti, priklausomai nuo ląstelių lokalizacijos ir laiko. Toliau aptarsime kelis pagrindinius, dažniausiai minimus kamieninėms ląstelėms būdingus signalinius kelius, kurie, tikėtina, didele dalimi lemia šių ląstelių „kamieniškumą“, t.y., „pažadina“ kamieninėms ląstelėms būdingų genų raišką.

 

Signaliniai keliai

Wnt kelias

Wnt signalinis kelias apima daugelio baltymų sąveikas – nuo Wnt molekulių sąveikos su taikininių ląstelių paviršiuje esančiu receptoriumi Frizzled iki pačios ląstelės fiziologinio atsako. Nors tokio atsako buvimas ir jo pasireiškimo efektyvumas priklauso nuo Wnt ligando, ląstelės tipo ir organizmo, bendra Wnt signalinio kelio schema yra gana konservatyvi daugelyje organizmų. Manoma, kad kaip tik Wnt signalinis kelias vaidina svarbų vaidmenį išlaikant kamienines (atskirais atvejais – ir piktybines) ląsteles savo nišose (Klapholz-Brown ir kt., 2007). Žinduolių genome egzistuoja devyniolika skirtingų Wnt genų, kurių produktai - hidrofobiniai signaliniai baltymai - jungiasi su Frizzled receptoriumi ląstelės paviršiuje (Willert ir kt., 2003). Wnt molekulių sekrecija ir jų poveikis į taikinines ląsteles yra labai sudėtingas procesas, turintis atgalinį grįžtamąjį ryšį.

Frizzled receptorių sudaro 7 transmembraninės molekulės su ilgu galiniu cisteinu turtingu domenu (2 pav.) Wnt signalo perdavimui reikia ne tik šio receptorinio baltymo, bet ir kitos ilgos transmembraninės molekulės LRP (angl. LDL receptor-related protein), kuri veikia kaip multifunkcinis endocitinis receptorius, stuburinių organizme jis vadinamas LRP5/6 (Dann ir kt., 2001). Citoplazminė LRP uodega gali tiesiogiai sąveikauti su aksinu, vienu iš Wnt signalinio kelio komponentų (Tolwinski irk t., 2003). Manoma, kad prisijungus Wnt baltymui, pasikeičia transmembraninių Frizzled ir LRP5/6 domenų konfigūracija. Perduodant signalą nuo ląstelės paviršiaus iki branduolio dalyvauja keli citoplazmos komponentai, iš kurių svarbiausias – β-kateninas, kuris patenka į branduolį ir sąveikauja su transkripcijos faktoriais, pvz.: TCF ar kt. Susidaręs kompleksas aktyvuoja daug įvairių taikininių genų. Šį kompleksą gali įtakoti ir kiti signalo perdavimo keliai – Notch, TGFβ faktorius, FGF ir Shh. Bet kuriuo atveju, šiame signaliniame kelyje neabejotinai pagrindinis vaidmuo tenka β-kateninui, kuris, nesant Wnt, degraduoja citoplazmoje ir, priešingai, Wnt perduoto signalo pasėkoje β-kateninas stabilizuojamas, kaupiamas citoplazmoje ir atlieka esminį vaidmenį indukuojant nuo Wnt priklausomų genų raišką.  

Text Box: 2 pav. Wnt signalinis kelias. 
Kairėje – neperdavus Wnt signalo, β-kateninas sąveikaudamas su Aksinu, APC ir baltymų kinaze GSK-3 degraduoja. 
Dešinėje – po Wnt baltymo sąveikos su Frizzled/LRP receptorių kompleksu ląstelės paviršiuje signalas perduodamas Dsh ir aksinui, kurie gali tiesiogiai sąveikauti. Šio proceso sąveikoje inhibuojama β-katenino degradacija, šis baltymas kaupiasi citoplazmoje ir branduolyje, vėliau jis  patenka į branduolį ir sąveikauja su TCF ir dalyvauja kontroliuojant transkripciją.
 
Adaptuota pagal Nusse, 2005.

2 pav. Wnt signalinis kelias.

Kairėje – neperdavus Wnt signalo, β-kateninas sąveikaudamas su Aksinu, APC ir baltymų kinaze GSK-3 degraduoja.

Dešinėje – po Wnt baltymo sąveikos su Frizzled/LRP receptorių kompleksu ląstelės paviršiuje signalas perduodamas Dsh ir aksinui, kurie gali tiesiogiai sąveikauti. Šio proceso sąveikoje inhibuojama β-katenino degradacija, šis baltymas kaupiasi citoplazmoje ir branduolyje, vėliau jis  patenka į branduolį ir sąveikauja su TCF ir dalyvauja kontroliuojant transkripciją.

 

Adaptuota pagal Nusse, 2005.

 

 

Wnt signalinių molekulių šeima reguliuoja daugelį gyvo organizmo vystymosi procesų – nuo mitogeninės stimuliacijos iki diferenciacijos. Apie šio ląstelės signalinio kelio reikšmę byloja faktai, jog analizuojant kai kurių degeneratyvinių ligų, vėžio atsiradimo mechanizmus aptikti kaip tik šio signalo perdavimo kelio sutrikimai.

Notch kelias

Notch signalinis kelias yra labai konservatyvus tarpląstelinės sąveikos signalo perdavimo būdas, aptinkamas evoliuciniu požiūriu labai skirtinguose organizmuose – nuo bestuburių iki žmogaus (Artavanis-Tsakonasir kt.,1999). Signalo perdavimo pradžia – kaimyninių ląstelių kontaktas per dviejų tipų transmembraninių baltymų - Delta ligando ir Notch receptoriaus, esančių ant kaimyninių ląstelių, sąveiką (3 pav.). Ši sąveika įtakoja gana platų kontakte dalyvaujančių ląstelių „lemties pasirinkimo“ spektrą – proliferaciją, diferenciaciją arba ląstelių žūtį/išgyvenimą, o tuo pačiu, neabejojama, įtakoja daugialąsčio organizmo morfogenezės procesus. Aktyvus Notch signalinis kelias dalyvauja procese, kuris dar vadinamas šoniniu stabdymu (angl. lateral inhibition), ir, tokiu būdu, įgalina kaimynines ląsteles įgyti tam tikrą fenotipą.

Žinduolių ląstelėse randami 4 skirtingi Notch receptoriai (1-4) ir 5 ligandai (JAG1, JAG2 ir DLL1, DLL2 ir DLL4). Šie transmembraniniai receptoriai ir ligandai skirtingų tipų ląstelėse dažniausiai (jei ne visada) ekspresuojami skirtingomis kombinacijomis. Nustatyta, kad ligando-receptoriaus indukuojamą signalą moduliuoja dar bent trys baltymai. Tai rodo, kad signalo kelias yra sudėtingas, jo galutinę išraišką, o tuo pačiu ir ląstelės likimą sprendžia daugelio baltymų kombinacijų sąveikos.

Ligando ir receptoriaus susijungimas įtakoja procesus, esančius abiejose kaimyninėse ląstelėse. Ligandą ekspresuojančioje ląstelėje aktyvuojami endocitozės mechanizmai. Tai paveikia Notch-Delta komplekso konformaciją, kurios pasikeitimas palengvina proteazėms priėjimą prie Notch baltymo ekstraląstelinio S2 segmento. Atskėlus ekstraląstelinį Notch domeną jis kartu su Delta ligandu keliauja į ligandą ekspresuojančią ląstelę, transportuojamas į endosomas ir greitai degraduoja.

 

Text Box: 3 pav. Notch signalinis kelias. Susijungus Delta ligandui ir Notch receptoriui palengvėja proteazių priėjimas prie Notch baltymo ekstraląstelinio S2 segmento. Atskeltas išorinis Notch ir Delta kompleksas keliauja į ligando ląstelę. Tuo tarpu pakinta likusio Notch baltymo konformacija, o tai palengvina proteazėms priėjimą prie S3 segmento vidinėje membranos dalyje, tokiu būdu atskeliamas viduląstelinis Notch segmantas, kuris keliauja į branduolį ir aktyvuoja transkripcijos faktorių CSL, o šis sąveikaudamas su koaktyvatoriumi (Co-A) aktyvina nuo Notch priklausomų genų  raišką. Nesant branduolyje viduląstelinio Notch fragmento, CSL siejasi su korepresoriaus kompleksu (Co-R), kuris aktyviai stabdo nuo Notch priklausomų genų transkripciją. 
 
Adaptuota pagal Lai, 2004.

 

      

 

Tuo tarpu atskilus ligando-receptoriaus kompleksui, keičiasi likusio Notch baltymo konformacija, palengvėja proteazėms priėjimas prie S3 segmento vidinėje membranos dalyje, tokiu būdu, atskeliamas viduląstelinis Notch segmantas, kuris keliauja į branduolį ir aktyvuoja transkripcijos faktorių CSL. Šis, sąveikaudamas su koaktyvatoriumi (Co-A), aktyvina nuo Notch priklausomų genų raišką. Nesant branduolyje viduląstelinio Notch fragmento, CSL siejasi su korepresoriaus kompleksu (Co-R), kuris aktyviai stabdo nuo Notch priklausomų genų transkripciją.

 

TGF-β kelias

TGF-β (angl. transforming growth factor β) – transformuojančių augimo veiksnių superšeima jungia BMP (angl. bone morphogenetic proteins), augimo ir diferenciacijos veiksnius GDFs (angl. growth and differentiation factors), AMH (angl. anti-mullerian hormone), aktyvinančius peptidus (angl. activin), centrinius polipeptidus (angl. nodal) ir TGF-β veiksnius. TGF-β signalinis kelias dalyvauja daugelyje procesų, vykstančių tiek embriono, tiek ir suaugusio organizmo ląstelėse, tai proliferacija, diferenciacija, apoptozė, migracija, ląstelių homeostazė bei kitos organizmo funkcijos - angiogenezė, uždegimas, žaizdos gyjimasir kt.

Neaktyvų TGF-β produkuoja daug ląstelių tipų, bet šis kompleksas negali jungtis su receptoriais. Tuo tarpu aktyvaus ekstraląstelinio TGF-β koncentracija priklauso nuo neaktyvaus TGF-β virtimo į aktyvųjį intensyvumo, tačiau net nedidelis aktyvaus TGF-β kiekio atsiradimas generuoja maksimalų ląstelių atsaką (Annes ir kt., 2003). Šiuo metu identifikuota daug veiksnių, kurie veikia kaip TGF-β aktyvatoriai, tai įvairios proteazės, tokios kaip plazminas, MMP-2 ir MMP-9 (angl. matrix metalloproteinase), reaktyvus deguonis, silpnai rūgštinė aplinka ir kt.

Nežiūrint į gausą procesų, kuriuos reguliuoja TGF-β superšeimos nariai, pats signalo perdavimo kelias nėra sudėtingas (4 pav.). Jis prasideda TGF-β ligandui prisijungus prie TGF-β II tipo receptoriaus. II tipo receptorius yra serino/treonino kinazė, kuri katalizuoja I-mo tipo receptoriaus fosforilinimą. Žinduolių organizme yra žinomi septynių rūšių II-o tipo receptoriai ir penkių rūšių I-mo tipo rezeptoriai (Munir ir kt., 2004). Kiekvienos rūšies ligandai jungiasi prie specifinio II-o tipo receptoriaus (Alberts ir kt., 2002).

Vėlesni įvykiai gali vykti pagal du scenarijus: signalas gali būti perduotas SMAD keliu arba alternatyviais būdais – aktyvuojant kitas signalines kaskadas.

Jei įvykiai vyksta pagal SMAD scenarijų, tada I-mojo tipo receptorius fosforilina receptoriaus reguliuojamą SMAD (R-SMAD), kuris gali jungtis prie ko-SMAD (SMAD4). R-SMAD/ko-SMAD kompleksai kaupiasi branduolyje, čia jie veikia kaip transkripcijos faktoriai ir dalyvauja reguliuojant taikininių genų raišką.

Jei signalas pasukamas kita kryptimi - TGF-β aktyvina kitas signalines kaskadas, tarp kurių yra ERK (angl. extracellular signalregulated kinase), JNK (angl. c-Jun-N-terminal kinase), TAK1 (angl. TGF-β-activated kinase 1), c-Abl (angl. Abelson nonreceptor tyrosine kinase)  (Bujak ir kt., 2007).

 

Text Box: 4 pav. Nuo SMAD priklausomas ir nuo SMAD nepriklausantis TGF-β signalinis kelias. TGF-β jungiasi su  II tipo receptoriumi, kuris yra serino/treonino kinazė, katalizuojanti I-mo tipo receptoriaus fosforilinimą. Aktyvintas I-mo tipo receptorius fosforilina pasirinktus R-SMAD. R-SMAD formuoja kompleksą  su SMAD4. Vėliau SMAD kompleksai keliauja į branduolį, kur jie reguliuoja taikininių genų transkripciją (TF). Struktūriškai skirtingi SMAD6 ir SMAD7 neigiamai įtakoja TGF-β signalo perdavimą. 
TGF-β signalas einantis kitu, nuo SMAD nepriklausomu keliu aktyvina Erk, JNK, p38MAPK, baltymų fosfatazės 2A (PP2A) ir RhoA kelius.
 
Adaptuota pagal Bujak ir kt., 2007

 

 

 

BMP signalinis kelias

BMP (angl. bone morphogenetic protein) yra vienas iš TGF- β superšeimos narių, jis originaliai buvo pavadintas baltymu, indukuojančiu kaulo formavimąsi nespecifinėje vietoje.

Klasikinėje BMP veikimo schemoje teigiama, kad BMP dimeras jungiasi su membraniniu kompleksu, kurį sudaro BMP receptoriai, vėliau fosforilinami reguliatoriai SMAD1 ir SMAD5, kurie jungiasi su SMAD4 (5 pav.). Šis susiformavęs SMAD kompleksas keliauja į branduolį ir jungiasi su transkripcijos faktoriais, susidaręs kompleksas dalyvauja reguliuojant genų ekspresiją. Toks kelias registruotas embriono kamieninių, Drosofilos lytinių ląstelių save atgaminančiame proliferaciniame procese bei postnataliniame organizme - pelės žarnų epitelio bei odos ląstelių proliferacijos stabdymo procesuose (Zhang ir Li, 2005). Kol kas nėra žinoma, ar BMP signalinis kelias dalyvauja atnaujinant suaugusio organizmo somatinių kamieninių ląstelių populiaciją (Wordinger ir kt., 2002). Tuo tarpu embriono vystymosi eigoje BMP dalyvauja gana priešingos krypties biologiniouse procesuose, tarp kurių - embriono nugarinės dalies formavimasis, proliferacija, mitozės stabdymas, galutinė diferenciacija ar apoptozė ir net onkogenezė (Varga ir Wrana, 2005). Nustatyta, kad šios, labai priešingos veikimo kryptys priklauso nuo SMAD moduliuojančių sąveikų su kitais transkripcijos faktoriais, tokiais kaip STAT, kuriuos aktyvina LIF, CNTF arba ir to paties BMP signalai (Chen ir Panchision, 2007). Matyt, šios visos priežastys suformavo nuomonę, kad BMP yra pagrindinis faktorius, apsprendžiantis kamieninių ląstelių vystymosi kryptį (Varga ir Wrana, 2005; Zhang, 2005).

 

Text Box: 5 pav. BMP (bone morphogenetic protein) signalinis kelias. BMP dimeras jungiasi su membraniniu kompleksu, kurį sudaro BMP receptoriai 1 ir 2 ir kurie yra serino/treonino kinazės. Vėliau fosforilinami reguliatoriai SMAD1 ir SMAD5, jie jungiasi su ko-SMAD 4 (SMAD4). Šis susiformavęs SMAD komleksas keliauja į branduolį ir jungiasi su transkripcijos faktoriais (TF) ir reguliuoja genų ekspresiją. 
Su BMP susijungę baltymai trukdantys BMP sąveiką su BMP receptoriais, veikia kaip BMP kelio antagonistai.
 
Adaptuota pagal Wordinger  ir kt., 2002

 

 

   

LIF signalinis kelias

LIF (angl. leukemia inhibitory factor) - interleukino 6 klasės citokinas, įtakojantis ląstelių augimą ir vystymąsi. Pavadinimas kilęs nuo šio citokino savybės indukuoti mieloidinės leukemijos ląstelių galutinę diferenciaciją. Šiuo metu nustatyta, kad šis citokinas dalyvauja tokiuose procesuose, kaip įvairių taikininių ląstelių proliferacijos ir diferenciacijos indukcija, nervų vystymasis, embriogenezė, uždegiminis procesas. Manoma, kad STAT3 aktyvinimas yra būtina ir pakankama sąlyga išlaikant nediferencijuotas embriono kamienines ląsteles (5 pav.) (Ura ir kt., 2008). Nustatyta visa eilė procesų, kurių reguliacijoje dalyvauja Stat3 kontroliuojami genai – tai onkogenezė, proliferacija, diferenciacija (pvz.: raumenų diferenciacija). Parodyta, kad Stat3 savo kontroliuojamus genus veikia reguliuodamas jų transkripcija, jo veikimas šių genų atžvilgiu gali bti tiek stabdantis, tiek ir aktyvinantis (Snyder ir kt., 2007).

LIF jungiasi su specifiniu LIF receptoriumi (LIFR), kuris formuoja heterodimerus su specifiniu, visiems šios šeimos nariams būdingu signalą perduodančiu subvienetu gp130. Toliau aktyvinamas JAK/STAT (Janus kinazė/signalo perdavėjas ir transkripcijos aktyvatorius) ir MAPK (mitogenų aktyvuota baltymų kinazės) kaskada. Vystantis embrionui LIF gaminamas trofoektodermoje, o vidinės blastocistos ląstelės turi jam receptorius. Jei šios ląstelės išskiriamos iš blastocistos ir nukreipiamos auginimui in vitro, reiškia, jos netenka kontakto su LIF šaltiniu, tuo pačiu, jos pasuka diferenciacijos kryptimi, tačiau išlaiko gebėjimą toliau palikyti savo nediferencijuotą būseną, matyt dėl to, kad jos nepraranda LIFR (receptorių). Dėl šios priežasties auginant pelių embrionines ląsteles kultūroje į kultyvavimo terpę pridedama LIF, kuris ir palaiko šias ląsteles nediferencijuotoje būsenoje, tačiau šio signalo nepakanka nediferencijuotoje būsenoje išlaikyti žmogaus embriono kamienines ląsteles (Daheron ir kt., 2004). Beje, ląstelių kultūroje dėl in vitro atliekamų genetinių manipuliacijų gali prasidėti nuo LIF nepriklausomas augimas, manoma, kad tada padidintais kiekiais ekspresuojamas genas Nanog (šio geno atradėjas jį senąja airių kalba pavadino “amžinos jaunystės šalies” vardu, arba, rimčiau – “meistru”, leidžiančiu embriono kamienines ląsteles in vitro palaikyti ir auginti nediferencijuotoje būsenoje) (http://www.sciencedaily.com/releases/2003/06/030602024530.htm).

Text Box:  
 
5 pav.  LIF signalo perdavimas embriono kamieninėse ląstelėse. 
LIF aktyvina bent du kelius: Janus kinazės/signalo perdavimo - transkripcijos aktyvatoriaus (JAK/STAT) bei Ras/mitogeno aktyvinamo baltymų (MAP) kinazės, kurie abu, neatmetama, gali ir susieiti. Šio kelio pabaigoje STAT šeimos nariai yra fosforilinami, translokuojami į branduolį ir dalyvauja reguliuojant genų transkripciją.
 
Adaptuota pagal
http://www.ims.u-tokyo.ac.jp/stem/research.html

 

 

 

Apibendrinimas

Aptarti signaliniai keliai įtakoja tiek embriono, tiek ir suaugusio organimo audiniuose esančių kamieninių ląstelių likimą. Tiesa, šie keliai ląstelėse yra labai susipynę, sunku būtų išskirti tokias grynas kaskadas, kokios aprašytos aukščiau pateiktose schemose. Sudėtingų ekstraląstelinių ir viduląstelinių sąveikų dėka kamieninės ląstelės realizuoja savo likimą – atnaujina savo populiaciją, dauginasi, sudaro klonus, viduląsteliniai signalai stabdo apoptozę, blokuoja diferenciaciją (Varga ir Wrana, 2005; Guo ir kt., 2008, Choi ir kt., 2008). Bet, kalbant apie kamienines ląsteles, norisi jas kaip nors apibūdinti, šioms ląstelėms priskirti kokias nors bendras savybes.

Taigi, kyla klausimas, kokie kamieninių ląstelių bruožai būdingi visoms kamieninėms ląstelėms, kaip jas galima atskirti nuo kitų ląstelių? Tarptautine iniciatyva didelis autorių kolektyvas apžvelgė 17-koje laboratorijų esančias 59-ias žmogaus embrionines kamieninių ląstelių linijas ir apibendrino jų požymius. Pasak autorių, nežiūrint į įvairius šių ląstelių genotipus ir skirtingas jų gavio ir auginimo sąlygas, šios ląstelės turėjo nemažai bendrų požymių: jos ekspresavo glikolipidinius antigenus SSEA3 ir SSEA4, keratano sulfato antigenus TRA-1-60, TRA-1-81, GCTM2 ir GCT343 bei baltyminius antigenus CD9, Thy1 (dar žinomą kaip CD90), audiniui nespecifinę šarminę fosfatazę, antigeną HLA1 bei griežtai vystymosi eigoje reguliuojamus genus - Nanog, Pou5F1 (seniau vadintą Oct4), TDGF1, DNMT3B, GABRB3 ir GDF3 (International Stem Cell Initiative, 2007).

Kai kuriuos iš šių požymių galima priskirti ir suaugusio organizmo kamieninėms ląstelėms. Jos, kaip žinia, randamos organizmo audiniuose po gimimo, yra išsidėsčiusios tarp diferencijuotų ląstelių, besidaugindamos gali atgaminti savo populiaciją, bet gali pasukti ir diferenciacijos kryptimi bei tapti tokiomis ląstelėmis, kokios yra jos kaimynės. Priešingai embrioninėms ląstelėms, suaugusio organizmo audiniuose esančių kamieninių ląstelių kilmė nėra aiški.

Dar labai neseniai buvo manoma, kad kamieninės ląstelės egzistuoja tik tuose audiniuose, kuriose aktyviai pasireiškia proliferacijos ir diferenciacijos procesai – hemopoezės organuose, epitelio gleivinėje, odoje, o kitų organų audiniuose pažeidimai atsistato dėl diferencijuotų ląstelių dalinimosi. Pavyzdžiui, buvo teigiama, kad po dalinės hepatektomijos proliferuoja subrendę kepenų ląstelės, kurios kompensuoja pašalintą parenchimą. Šios ilgai egzistavusios tiesos dabar paneigtos eksperimentais, kurie įrodo, kad dauginasi tik nediferencijuotos kamieninės ląstelės, dar daugiau, nediferencijuotos hemopoetinės kamieninės ląstelės gali duoti pradžią tiek kepenų, tiek ir raumenų ar smegenų ląstelėms. Yra ir atvirkštinių įrodymų – ląstelių, su šiems organams būdingais žymenimis, galima rasti ir kraujyje, ir kaulų čiulpuose (Wulf ir kt., 2001; Jackson ir kt., 2002).

Šiuo metu pasaulyje atliekama galybė eksperimentų, kurie analizuoja visų lygių kamieninių ląstelių savybes - nuo totipotentinės (zigotos) iki polipotentinių embrioninių ir multipotentinių ar bipotentinių suaugusio organizmo kamieninių ląstelių. Mokslininkų darbų rezultatais labai domisi gydytojai praktikai, kurie mato dideles perspektyvas šias ląsteles panaudoti regeneracinei medicinai – pažeistų organų audinių atkūrimui. Daug vertingos informacijos suteikia kamieninių ląstelių plastiškumo (suaugusio organizmao diferenciacijos) tyrinėjimai. Analizuojant šį reiškinį atsakymus į rūpimus klausimus randa ir vystymosi biologijos, ir onkologijos specialistai. Postnatalinio organizmo kamieninių ląstelių savybė diferencijuotis įvairiomis kryptimis prilyginama embrioninių ląstelių diferenciaciniam aktyvumui. Tai įgalina tyrėjus daugelyje eksperimentų vietoje embriono ląstelių naudoti suaugusio organizmo kamienines ląsteles, išvengiant etinių problemų, kurios atsiranda eksperimentuojant su prenatalinio organizmo ląstelėmis.  Tyrimų eigoje paaiškėjo labai glaudus kamieninių ląstelių ir kancerogenezės proceso ryšys, kuris turėtų būti vertas atskiro aprašymo.

Kamieninių ląstelių tyrimus lydi ir neadekvatus domėjimasis jomis, kaip gyvybės pradžia. Labai dažnai kyla bioetinis konfliktas, kai susiduria naujos gyvybės atsiradimą saugančių šalininkų interesai su mokslininkų, kuriančių naujas technologijas, skirtas žmogaus sveikatai, darbais. Pirmieji, dažnai nepelnytai, kamieninių ląstelių gavimo ir tyrimo procese įžvelgia gyvybės naikinimą. Tačiau, žinoma, nėra paslaptis ir tai, kad auga klonavimo šalininkų dėmesys, kurį paskatino avytės Doli atsiradimas, pranešama ir apie 1997-1998, 2001 m. klonuotą žmogaus embrioną. Nors, kaip žinia, klonavimo tikslai taip pat nėra vienareikšmiai. Jie gali būti siejami tiek su neprognozuojamais piktais kėslais, tiek ir su teigiamomis paskatomis – donorinių organų auginimu arba transgeninių gyvūnų (dažniausiai pelių), skirtų žmogaus ligų modeliavimui, gavimu.

Visa tai rodo, kad kamieninės ląstelės yra įdomios, jų tyrimai reikšmingi, o mokslo visuomenės darbų rezultatų su nekantrumu laukia gydytojai ir jų pacientai.

 

 

 

Literatūra

1.       Alberts B., A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, P. Walter (2002). Molecular Biology of the Cell. New York, NY: Garland Science.

2.       Annes J.P., J.S. Munger, D.B. Rifkin (2003). Making sense of latent TGFβ activation. J. Cell Sci. 116:  217-24.

3.       Artavanis-Tsakonas, S., M.D. Rand, R.J. Lake (1999). Notch signaling: cell fate control and signal integration in development. Science 284: 770–6.

4.       Bujak M., N. G Frangogiannis (2007). The role of TGF-β Signaling in Myocardial Infarction and Cardiac Remodeling. Cardiovasc. Res. 74(2): 184–95.

5.       Byrne J.A., D.A. Pedersen, L.L. Clepper, M. Nelson, W.G. Sanger, S. Gokhale, D. P. Wolf, S.M. Mitalipov (2007). Producing primate embryonic stem cells by somatic cell nuclear transfer. Nature 450, 497-502.

6.       Chen H.-L., D.M. Panchision (2007).  Concise review: Bone morphogenetic protein pleiotropism in neural stem cells and their derivatives—alternative pathways, convergent signals. Stem Cells  25 (1): 63 -8.

7.       Choi J., L.K. Southworth, K.Y. Sarin,  A.S. Venteicher, W. Ma, W. Chang, P. Cheung, S. Jun, M.K. Artandi, N. Shah, S.K. Kim, S.E. Artandi. (2008). TERT promotes epithelial proliferation through transcriptional control of a mycand Wnt-related developmental program. PLoS Genet. 4(1): e10.

8.       Chung Y., I. Klimanskaya, S. Becker, T. Li, M. Maserati, S.-J. Lu, T. Zdravkovic, D. Ilic, O. Genbacev, S. Fisher, A. Krotolica, R.Lanza (2008). Human embryonic stem cell line generated without embryo destruction. Cell Stem Cell doi: 10.1016/j.stem.2007.12.013

9.       Dann C.E., J.C. Hsieh, A. Rattner, D. Sharma, J. Nathans, D.J. Leahy (2001). Insights into Wnt binding and signaling from the structures of two Frizzled cysteine-rich domains. Nature, 412: 86-90.

10.    Daheron L, S.L. Opitz, H. Zaehres, W.M. Lensch, P.W. Andrews, J. Itskovitz-Eldor, G.Q. Daley. (2004). LIF/STAT3 signaling fails to maintain self-renewal of human embryonic stem cells. Stem Cells, 22(5): 770-8.

11.    Danet G.H., J.L. Luongo, G. Butler, M.M. Lu, A.J. Tenner, M.C. Simon, D.A. Bonne (2002). C1qRp defines a new human stem cell population with hematopoietic and hepatic potential. Proc Natl  Acad Sci U. S. A. 99(16): 10441–5.

12.    Denner L., Y. Bodenburg, J. G. Zhao, M. Howe,  J. Cappo, R. G. Tilton, J. A. Copland, N. Forra, C. McGucki,  R. Urban (2007). Directed engineering of umbilical cord blood stem cells to produce C-peptide and insulin. Cell Proliferation, 40 (3): 367-80.

13.    Griffin H., I. Wilmut I. (1997). Seven days that shook the world. New Sci. 153(2074): 49.

14.    Guo W, J.Flanagan, R. Jasuja , J.L.Kirkland, L. Jiang, S. Bhasin. (2008). The effects of myostatin on adipogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells are mediated through cross-communication between Smad3 and WNT/beta-catenin signaling pathways. J Biol Chem. (Epub ahead of print).

15.    Evans M., M. Kaufman (1981). Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 292 (5819): 154-6.

16.    Evans M.J. (1981). Origin of mouse embryonal carcinoma cells and the possibility of their direct isolation into tissue culture, J. Reprod. Fert., 62: 625-31.

17.    Frencha A.J., C.A. Adamsb, L.S. Andersonb, J.R. Kitchenc, M.R. Hughesc, S.H. Wood (2008). Development of human cloned blastocysts following somatic cell nuclear transfer (SCNT) with adult fibroblasts. Stem Cells Express, (published online January 17, 2008); doi:10.1634/stemcells.2007-0252.

18.    Fuchs E., T.Tumbar, G. Guasch (2004). Socializing with the neighbors: stem cells and their niche. Cell 116(6): 769-78.

19.    International Stem Cell Initiative, Adewumi O, Aflatoonian B ir kt (iš viso virš 60 autorių) (2007). Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 25(7): 803-16.

20.    Jackson K.A., S.M. Majka, G.G. Wulf, M.A. Goodell (2002). Stem cells: A minireview. J. Cell Biochem. Suppl. 85(38): 1-6.

21.    Klapholz-Brown Z, G.G. Walmsley , Y.M. Nusse , R. Nusse , P.O. Brown . Transcriptional program induced by wnt protein in human fibroblasts suggests mechanisms for cell cooperativity in defining tissue microenvironments. PLoS ONE. 2007 Sep 26;2(9):e945

22.    Lai E.C. (2004). Notch signaling: control of cell communication and cell fate. Development, 131 (5): 965-73.

23.    Martin G. (1981). Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 78 (12): 7634-8.

24.    McCulloch E.A., J.E. Till (2005). Perspectives on the properties of stem cells. Nature Medicine, 11(10): v-vii.

25.    Mitalipov S.M., Q. Zhou , J.A. Byrne , W.Z. Ji , R.B. Norgren, D.P.  (2007). Reprogramming following somatic cell nuclear transfer in primates is dependent upon nuclear remodeling. Hum Reprod.22(8): 2232-42.

26.    Munir S., G. Xu, Y. Wu, B. Yang,  P.K. Lala, C. Peng. (2004). Nodal and ALK7  inhibit proliferation and induce apoptosis in human trophoblast cells. J Biol Chem. 279 (30): 31277-86.

27.    Nusse R. (2005). Wnt signaling in disease and in development. Cell Research, 15(1): 28-32.

28.    Paratore Ch., L. Sommer (2006). Stem cells. In: Cell signaling and growth factors in development. Ed. by K. Unsicker and K. Krieglstein. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

29.    Prindull G., B. Prindull, N. Meulen  (1978). Haematopoietic stem cells (CFUc) in human cord blood. Acta Paediatr. Scand. 67(4): 413-4.

30.    Siminovitch L, E.A. McCulloch, J.E. Till (1963). The distribution of colony forming cells among spleen colonies. J Cell Comp Physiol.  62: 327–36.

31.    Snyder M, X.Y. Huang, J.J. Zhang (2007). Identification of novel direct STAT3 target genes for control of growth and differentiation. J Biol Chem. [Epub ahead of print].

32.    Takahashi K., S. Yamanaka (2006). Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126: 663-76.

33.    Thomson J.A., J. Kalishman, T.G. Golos, M. Durning, C.P. Harris, R.A. Becker J.P. Hearn. (1995) Isolation of a Primate Embryonic Stem Cell Line. Proc Natl Acad Sci U S A 92(17): 7844-8.

34.    Thomson J.A., J. Itskovitz-Elder, and S.S. Shapiro, M.A. Waknitz, J.J. Swieegiel, V.D. Marshall, J.M. Jones (1998). Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts Science 282: 1145-7.

35.    Till J.E., E.A. McCulloch (1961). A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat Res; 14: 213–22.

36.    Tolwinski N.S., M. Wehrli, A. Rives (2003).Wg/Wnt signal can be transmitted through arrow/LRP 5,6 and Axin independently of Zw3/Gsk3beta activity. Dev. Cell 4: 407-18.

37.    Ura H, M. Usuda, K. Kinoshita, C. Sun, K. Mori, T. Akagi, T. Matsuda, H. Koide, T. Yokota (2008). STAT3 and Oct-3/4 control histone modification through induction of Eed in embryonic stem cells. J Biol Chem. 2008 (Epub ahead of print).

38.    Varga A.C., J.L. Wrana. (2005). The disparate role of BMP in stem cell biology. Oncogene. 24(37): 5713-21.

39.    Willert K., J.D. Brown, E. Danenberg, A.W. Duncan, I.L. Weissman, T. Reya,  J.R.Yates 3rd, R. Nusse (2003). Wnt proteins are lipid-modified and can act as stem cell growth factors. Nature, 423(6938): 448-52.

40.    Wordinger R.J., R. Agarwal, M. Talati, J. Fuller, W. Lambert, A.F. Clark (2002). Expression of bone morphogenetic proteins (BMP), BMP receptors, and BMP associated proteins in human trabecular meshwork and optic nerve head cells and tissues. Molecular Vision, 8: 241-250.

41.    Wulf, G.G., K.A. Jackson, M.A. Goodel (2001). Somatic stem cell plasticity: Current evidence and emerging concepts. Exp. Hematol. 29(12), 1361-70.

42.    Yu J., M.A. Vodyanik, K. Smuga-Otto, J. Antosiewicz-Bourget, J.L. Frane,1 S. Tian,3 J. Nie,3 G.A. Jonsdottir, V. Ruotti, R. Stewart, I.I. Slukvin, J.A. Thomson (2007) Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science, 318(5858): 1917-20.

43.    Zhang J, L. Li. (2005). BMP signaling and stem cell regulation. Dev Biol. 284(1):1-11.


Naturales Scientiae Omnibus