Kurkime ateitį drauge!

Rita Verbylaitė, Jonas Žiauka

Lietuvos miškų institutas

Fitohormonų svarba augalų ir mikroorganizmų simbiozės santykiams

 

„

Fitohormonai (augalų hormonai) yra nedideliais kiekiais augaluose aptinkamos cheminės medžiagos, kontroliuojančios augalo augimą ir vystymąsi. Tokie augimo reguliatoriai akivaizdžiai dalyvauja daugelyje fiziologinių procesų. Jie veikia augalo vystymąsi kontroliuodami specifines biochemines reakcijas. Fitohormonų koncentracijos augaluose paprastai esti labai mažos.

Augalų augimo reguliatorius gamina ne tik patys augalai, bet ir daugelis mikroorganizmų (bakterijų bei grybų). Beveik visi žinomi augalų hormonai, tarp jų ir penkios „klasikinių“ hormonų grupės (citokininai, auksinai, giberelinai, etilenas, abscizo rūgštis), yra išskiriami tam tikrų mikroorganizmų rūšių. Bakterijos bei grybai dažnai geba sintetinti sąlyginai didesnius fitohormonų kiekius nei patys augalai, todėl kartais netgi nelengva nustatyti, ar augale aptinkami hormonai yra paties augalo gaminamas produktas, ar juos augalas yra gavęs iš drauge gyvenančių mikroorganizmų. Taip ilgą laiką buvo neaišku, ar fitohormonai citokininai (viena iš geriausiai žinomų fitohormonų grupių) tikrai sintetinami augaluose, ar tai vien tik su augalais susijusių mikroorganizmų produktas. Bendrieji fitohormonų sintezės keliai augaluose ir kituose organizmuose dažniausiai yra panašūs, tačiau mikroorganizmai paprastai gamina fitohormonus kaip galutinius medžiagų apykaitos produktus ir patys jiems yra nejautrūs. Vis dėlto dažnai ryšiai tarp augalų ir mikroorganizmų esti tokie glaudūs, jog pastarųjų išskiriami augimo reguliatoriai turi didelę svarbą ne tik augalams, bet per augalo metabolinius procesus ir patiems mikroorganizmams. Mikroorganizmų išskiriami fitohormonai padeda jiems palaikyti su augalais simbiotinius santykius, t.y. glaudų tarpusavio sugyvenimą.  Šis sugyvenimas gali būti įvairaus pobūdžio: mutualizmas (abipusiai naudingas sugyvenimas), komensalizmas (augalas yra būstas ir maisto šaltinis, bet tai jam nekenkia), parazitizmas (mikrobinis parazitas gyvena ir minta augale, sukeldamas jo funkcijų susilpnėjimą arba žūtį).

Bakterijos ir grybai, išskiriantys citokininus, šių fitohormonų pagalba geba pakreipti augalo vystymąsi sau palankia linkme. Fiziologinis citokininų veikimas pasireiškia tuo, jog jie skatina ląstelės dalijimąsi, naujų ūglių formavimąsi, stabdo lapų senėjimą (padeda išsaugoti chlorofilą), sulaiko lapų ir žiedų kritimą, aktyvuoja ramybės būsenoje esančius šoninius pumpurus. Įrodyta, jog citokininus gamina daugelis ant augalų šaknų gyvenančių bakterijų, tarp jų Bradyrhizobium, Azotobacter, Arthrobacter, Streptomyces, taip pat ir aktinomicetai Frankia, fiksuojantys azotą ant alksnių bei kai kurių kitų sumedėjusių augalų šaknų. Mikorizę sudarantys grybai taip pat gamina citokininą zeatiną. Kai kurios dirvoje gyvenančios fitopatogeninės bakterijos (pavyzdžiui, Agrobacterium, Pseudomonas), išskirdamos citokininus, sukelia gumbų bei auglių susidarymą augaluose. Fakultatyviai metilotropinės bakterijos Methylobacterium, labai paplitę dirvoje ir ant augalų lapų paviršiaus, geba gaminti zeatiną ir zeatino ribozidą. Sėklų, ant kurių šių mikroorganizmų kiekis sumažinamas, daigumas prastėja. Tačiau inokuliavus sėklas metilobakterijomis arba aprūpinus jas citokininais, atstatomas normalus sėklų dygimas. Panašūs rezultatai gauti ir tiriant daigų augimą. Daigų, augančių be įprasto metilobakterijų kiekio, šaknys esti sunykusios. Normalus šaknų vystymasis atstatomas, jei augalas inokuliojamas metilobakterijomis arba aprūpinamas citokininais. Lapų užkrėtimas Methylobacterium padidina sojos pupelių derlių. Įdomu, jog metilobakterijos sutinkamos netgi augalų audinių kultūrose, pavyzdžiui, visose šiuo atžvilgiu tirtose tabako audinių kultūrose su iš kaliaus  regeneruojančiais ūgliais aptiktas ir tam tikras metilobakterijų  kiekis. Savo ruožtu bakterijos, išskirdamos citokininus, kurie skatina augalo ląstelių dalijimąsi ir augimą, sukelia metanolio išskyrimą iš augalo ląstelės sienelės ir taip apsirūpina maisto medžiagomis. Nustatyta, kad meristeminiuose paprastosios pušies pumpurų audiniuose aptinkamos bakterijos Methylobacterium extorquens ir mielės Rhodotorula minuta išskiria adenino darinius, kurie gali būti citokininų biosintezės pirmtakai. Paprastosios pušies audinių kultūroje šie mikroorganizmai geba atstatyti tetraciklinu sustabdytą kaliaus susidarymą, taip pat sušvelnina eksplantų rudavimą.

Citokininus gamina ir tam tikri fitopatogeniniai grybai (Helminthosporum, Ustilago bei kiti), kurie pateikia įdomų citokininų lemiamos senėjimo procesų inhibicijos pavyzdį: šiais grybais užsikrėtę augalo lapai išlaiko žalias saleles aplink infekcijos vietą tuo metu, kai likusi lapo dalis praranda žalią spalvą. Citokininų sintezė padeda mikroorganizmams, kaip anglies šaltinį naudojantiems sacharidus, apsirūpinti maistu kritinėmis sąlygomis. Rudenį, gelstant medžių lapams, sacharozės molekulės iš lapų intensyviai pernešamos į  sacharozės sandėliavimo vietas kamiene. Mikroskopiniai lapų parazitai (bakterijos ir grybai) tokiu atveju netenka pagrindinio maisto šaltinio ir žūva. Citokininų tipo fitohormonų išskyrimas padeda mikroorganizmams išgyventi ilgesnį laiką. Citokininai skatina sacharozės molekulių skaidymą į mažesnes cukraus molekules, kurios nėra pernešamos į kamieną ir tokiu būdu lieka mikroorganizmams kaip maisto šaltinis. Gelstančiame lape tokiu būdu susidaro žalios salelės (1 pav.).

 

1 pav. Grybo Diplocarpon rosae sukeliami pažeidimai ant rožės lapų. Juodos dėmės žymi grybienos išplitimą, tačiau aplink jas lapas išlieka žalias dėl grybo išskiriamų citokininų, nors likusi lapo dalis nugelsta (E.W. Gachomo, 2004)

 

Patogeninių bakterijų išskiriami citokininai gali stipriai paveikti augalo fenotipą. Gerai žinomas Agrobacterium tumefaciens bei Corynebacterium sp. išskiriamų citokininų poveikis. Augaluose jis pasireiškia neįprastu ūglių išsišakojimu, vadinamųjų “raganų šluotų” susidarymu. Tačiau ne visos ant ūglių gyvenančios bakterijos yra patogeninės. Pavyzdžiu gali būti ant ardizijos (Ardisia crispa) lapų gyvenančios simbiontinės bakterijos, kurios ant lapų įsikuria besivystant daigui iš užkrėstų sėklų. Retkarčiais iš Ardisia crispa sėklų išsivysto fenotipiškai išsigimę, silpni daigai, kurie nustoja augti netrukus po sudygimo. Viršūninės tokių augalų meristemos esti panašios į kaliaus audinį. Tokioje būsenoje augalai gali išgyventi vienerius metus ar ilgiau. Vėliau jie arba tęsia normalų augimą, arba žūva. Buvo parodyta, kad išsigimęs ardizijų fenotipas susijęs su pernelyg nedideliu sėklą užkrėtusių bakterijų kiekiu. Apdorojus sėklas taip, kad bakterinis užkratas būtų sunaikintas, išsigimimų dažnis išauga, tačiau nenormalus fenotipas gali būti ištaisytas pridedant citokininų. Taigi šios rūšies augalai yra priklausomi nuo citokininus sintetinančių mikroorganizmų. Natūralus normalaus fenotipo atsistatymas gali būti susijęs su tuo, jog iš pradžių nedidelės simbiontinių mikroorganizmų populiacijos išauga iki lygio, reikalingo palaikyti normalų daigų augimą.

 Didelę reikšmę augalus puolantiems grybams bei bakterijoms turi jų išskiriami auksinai. Mikroorganizmai paprastai gamina indolilacto rūgštį (IAR) – patį įprasčiausią augaluose sutinkamą auksiną. Nustatyta, kad auksinai stipriai padidina bakterijų ir grybų virulentiškumą. Tai pastebėta tiriant tiek rizosferos, tiek filosferos mikroorganizmus. Išskiriami auksinai ypač svarbūs pačios infekcijos momentu. Jie lemia celiulazės katalizuojamą hemiceliuliozės skėlimą, kurio rezultatas yra ląstelės sienelės praradimas ir membranos pratakumo padidėjimas. Tai lemia vandens bei maisto medžiagų ištekėjimą iš augalo ląstelės. Tokiu pačiu principu veikia ir herbicidiniu poveikiu pasižymintys sintetiniai auksinai, pavyzdžiui, 2,4-dichlorfenoksiacto rūgštis (2,4-D). Dauguma mikroorganizmų (įskaitant ir grybus), susijusių su augalais parazitiniais arba kitokiais simbiontiniais ryšiais, smarkiai pakeičia auksinų kiekį augalo-šeimininko audiniuose. Grybo Uromyces pisi infekuotose karpažolių viršūnėse aptinkami 10 kartų didesni auksino kiekiai nei sveikose viršūnėse. Tarp atskirų patogenų linijų virulentiškumo bei jų išskiriamos IAR kiekio nustatyta tiesioginė koreliacija. Gindamiesi nuo grybinės infekcijos, augalo audiniai išskiria chitinazę (fermentą, gebantį ardyti chitininę grybo ląstelių sienelę), tačiau auksinas blokuoja šio femento gamybą. Taip pat ir visos bakterijos, lemiančios gumbų susidarymą ant augalo šaknų ar antžeminės dalies, gamina IAR. Mutantinės linijos, nesugebančios gaminti auksino, negali indukuoti ir auglių susidarymo. Pilnas tokių bakterijų virulentiškumas atstatomas tik transformavus jas IAR sintezės genais. Mikroorganizmai geba IAR iš aminorūgšties triptofano pasigaminti įvairiais būdais: vieni per indolilpiruvo rūgštį, antri per indolilacetamidą, o dar kiti auksiną iš triptofano gamina ir vienu, ir kitu keliu (tuo tarpu augaluose pagrindinis IAR biosintezės kelias yra jos gamyba iš triptofano per indolilpiruvo rūgštį). Mikroorganizmams ypač svarbi IAR gamyba per indolilacetamidą. Augalams patogeniškos bakterijos Erwinia herbicola linijos naudoja indolilacetamido metabolinį kelią IAR gamybai, tuo tarpu nepatogeniškoms šios bakterijos linijoms toks metabolinis kelias nebūdingas. Izraelio mokslininkai atliko eksperimentą transformuodami patogeninius Fusarium genties grybus genais, lemiančiais IAR sintezę iš triptofano per indolilacetamidą. Tai buvo atlikta ekonominiais sumetimais, kadangi Fusarium puola parazitinį augalą džioveklę, galintį padaryti didelių nuostolių kultūrinių augalų derliui. Kaip ir tikėtasi, transformuoti grybai gamino didesnius IAR kiekius ir tuo pačiu pasižymėjo didesniu virulentiškumu. Tokie grybai smarkiau sumažino džioveklių ūglių skaičių bei dydį, lyginant su laukinio tipo Fusarium. Šių mikoherbicidų (piktžoles naikinančių grybų) poveikis buvo pakankamai specifiškas, kadangi nukentėjo tik džioveklės bet ne džioveklių parazituojami pomidorai.

Tiriant augalų patogeninį grybą Colleotrichum gloeosporioides taip pat buvo parodyta, jog šis grybas gamina IAR iš triptofano per indolilacetamidą. Nustatyta, kad sąlyginai didesnius auksino kiekius užpultame augale grybas gamina  biotrofnėje infekcijos fazėje, kai paties grybo biomasė (micelis) dar nėra didelė ir jis maitinasi gyvais augalo audiniais. Nekrotrofinėje fazėje, kuomet grybo micelis smarkiai auga ir sąlygoja didelius augalo audinių pažeidimus, IAR kiekis, kurį pagamina grybo biomasės vienetas, yra daug mažesnis nei pradinėje infekcijos stadijoje. Tam, kad grybas galėtų pastoviai gaminti IAR, jam reikalingas išorinis aprūpinimas triptofanu, kurį infekcijos pradžioje teikia gyvos augalo ląstelės.

Rizosferos grybų išskiriamas auksinas svarbus mikorizei (abipusiai naudingai augalų šaknų simbiozei su grybais) susidaryti. Mikorizė būdinga tiek žoliniams, tiek sumedėjusiems augalams. Endotrofinės mikorizės atveju grybas pro šakniaplaukius įsiskverbia į augalo šaknies pirminės žievės ląstelių vidų ir čia išsiraizgo. Vis dėlto grybo hifai pro augalo ląstelės plazminę membraną neprasikverbia, tačiau, prasiskverbę pro ląstelės sienelę, suformuoja savotiškų išaugų tinklą, kuris smarkiai padidina grybienos sąlyčio su plazmine membrana paviršių. Tuo tarpu ektotrofinę mikorizę sudarantys grybai tankiu rezginiu apipina augalų šaknis, siterpia į tarpuląsčius, bet į ląstelių vidų dažniausiai neįsiskverbia (pastarasis mikorizės tipas būdingas daugumos mūsų medžių šaknims: ąžuolams, beržams, pušims, eglėms, maumedžiams, drebulėms.). Inokuliavus paprastosios eglės sėjinukus IAR gaminančiu ektomikoriziniu grybu Laccaria bicolor, buvo pastebėtas būdingas auksino poveikis: iš pradžių sulėtėjęs, o vėliau stimuliuotas pagrindinės šaknies ilgėjimas, intensyvesnis šoninių šaknų formavimasis bei sėjinukų epikotilių augimas, didesnis spyglių skaičius. Tuo tarpu į maitinamąją terpę pridėtas auksino pernašos inhibitorius trijodobenzoinė rūgštis neleido ektomikoriziniam grybui paskatinti pridėtinių šaknų susidarymo. Taigi grybo išskiriamo auksino pernaša šaknyje reikalinga tam, kad intensyviai formuotųsi šoninės šaknys ir tarp grybo bei augalo galėtų nusistovėti simbiotiniai santykiai (mikorizė).

 

 

2 pav. Grybo Pisolithus tinctorius sudaryta ektomikorizė ant didžiosios pocūgės (Pseudotsuga menziesii) šaknų. Kairėje – kontrolinių augalų šaknys, dešinėje – augalų, augusių dirvoje, praturtintoje 10-7 M triptofano, kuris yra pirminė medžiaga biologinėje auksino indolilacto rūgšties sintezėje (W.T. Frankenberger ir M. Poth, Applied and Enviromental Microbiology, 1987)

 

Augalų genetinėje transformacijoje plačiai naudojamos bakterijos Agrobacterium pasižymi geba priversti patį augalą infekcijos eigoje gaminti auksinus bei citokininus. Gerai žinomos ir labiausiai ištirtos yra A. tumefaciens, kurios pro pažeistas vietas užkrečia įvairių rūšių augalus ir ant jų stiebų ar šaknų susiformuoja „vainikiniai“ augliai, kitaip vadinami galais (angl. crown galls). Dar viena plačiai paplitusi šios genties bakterija yra A. rhizogenes. Šiai bakterijai patekus į augalą šeimininką, susiformuoja „plaukuotos“ šaknys (angl. hairy root). Agrobakterijos sugeba savo DNR įterpti į augalų ląsteles. Dėl šios savybės jos tapo labai patogia genetinės inžinerijos priemone, padedančia pagerinti augalų savybes. A. tumefaciens turi išskirtinį gebėjimą perkelti tam tikrą DNR segmentą (T-DNR) iš vėžį sukeliančios (Ti) plazmidės į infekuotų ląstelių branduolius, kur segmentas yra stabiliai integruojamas į šeimininko genomą ir transkribuojamas. Taip sukeliama vainikinių gumbų liga. T-DNR turi dviejų tipų genus: onkogenus, kurie koduoja auksinus bei citokininus sintetinančius fermentus ir yra atsakingi už augalų vėžio formavimąsi, bei genus, koduojančius opinų sintezę. Šios medžiagos, gaminamos kondensacijos būdu iš aminorūgščių ir cukrų, yra išskiriamos vėžinių ląstelių į aplinką, kur A. tumefaciens sunaudoja jas kaip anglies ir azoto šaltinį. Suformuotuose augliuose pertvarkomas augalų ląstelių metabolitinis kelias. Opinai pradedami sintetinti kuomet augalo ląstelė užkrečiama A. tumefaciens. Koks opinas bus gaminamas, priklauso ne nuo augalo, bet nuo bakterijos kilmės. Paprastai bakterija indukuoja to opino sintezę, kurį ji pati gali katabolizuoti ir naudoti kaip savo vienintelį energijos šaltinį. Vadinasi, bakterija, kuri naudoja oktopiną, indukuoja oktopiną sintetinančius navikus, o nopaliną naudojančios bakterijos skatina auglių, gaminančių nopaliną, augimą.

Virulentiški A. tumefaciens ir A. rhizogenes kamienai, veikdami jautrias dviskilčių augalų ląsteles  atitinkamai sukelia ligas, žinomas kaip „vainikiniai gumbai“ ir „plaukuotos šaknys“. Šie kamienai turi didelę megaplazmidę (daugiau nei 200 kb), kuri atlieka pagrindinį vaidmenį augalų vėžio indukcijoje ir dėl šios priežasties buvo pavadinta Ti (tumor inducing), arba Ri (root inducing) A. rhizogenes atveju. Infekcijos metu T-DNR, mobilus Ti ar Ri plazmidės segmentas, yra pernešama į augalo ląstelės branduolį ir integruojamas į augalo chromosomą.

 

 

 

3 pav. Agrobacterium tumefaciens Ti plazmidės organizacija. Adaptuota pagal www.cambiaip.org/ diags/Ti_plasmid.jpg

 

 

4 pav. Auksino naftalenacto rūgšties (NAR) sąlygotas „plaukuotų šaknų“ susidarymas paprastosios drebulės in vitro kultūroje (kairėje), primenantis Agrobacterium rhizogenes poveikį (dešinėje, iš http://www.csiro.au/index.asp?type=imageDef&id=hairyroots_lg)

 

Fitohormoną gibereliną taip pat gamina įvairios bakterijos bei grybai. Giberelinas pirmiausia ir buvo atrastas kaip ryžius parazituojančių grybų (Gibberella fujikuroi), sukeliančių nenormalų ryžių daigų augimą, išskiriamas produktas. Giberelino gamyba ypač paplitusi tarp rizosferoje gyvenančių grybų. Dirvožemio grybų išskiriamas giberelinas gali būti itin reikšmingas augalų augimui nepalankiomis sąlygomis (pavyzdžiui, druskingoje dirvoje), kadangi tai yra sėklų daigumą bei sėjinukų gyvybingumą (augimą) skatinantis fitohormonas.

 

 

 

Literatūra

 

Cohen B.A., Amsellem Z., Maor R., Sharon A., Gressel J. 2002. Transgenically enhanced expression of indole-3-acetic acid confers hypervirulence to plant pathogens. Phytopathology 92: 590-596.

Frankenberger W.T., Poth M. 1987. Biosynthesis of indole-3-acetic acid by the pine ectomycorrhizal fungus Pisolithus tinctorius. Aplied and Enviromental Microbiology 53: 2908-2913.

Gachomo E.W. 2004. Studies of the life cycle of Diplocarpon rosae Wolf on roses and the effectiveness of fungicides on pathogenesis. Cuvillier Verlag, Goettingen.

Lidstrom M.E., Chistoserdova L. 2002. Plants in the pink: Cytokinin production by Methylobacterium. Journal of Bacteriology 184: 1818.

Lindow S.E., Brandl M.T. 2003. Microbiology of the phyllosphere. Aplied and Enviromental Microbiology 69: 1875-1883.


Naturales Scientiae Omnibus