Kurkime ateitį drauge!

Prof. Vida Mildažienė, doc. Zita Naučienė

Baltymų makiažas – posttransliacinės modifikacijos

Pogenominė era atnešė daug naujų atradimų. Paskutiniojo dešimtmečio moksliniai tyrimai sugriovė galiojusias dogmas ir iš esmės pakeitė supratimą apie gyvybės sudėtingumą. Viena iš paplitusių vadovėlinių tiesų buvo aiškinimas, kad juo sudėtingesnis organizmas, tuo daugiau genų jis turi. Nuskaičius žmogaus genomą ir palyginus jame esančių struktūrinių genų skaičių su kitų organizmų rūšių genų skaičiumi, nustatyti faktai leidžia teigti, kad tokia dogma galioja tik lyginant labai tolimų evoliucijos pakopų organizmus – pavyzdžiui, virusus ar bakterijas su eukariotais. Aukštesniųjų eukariotų baltymus koduojančių genų skaičius (20 -30 tūkst.) panašus į   kirmėlių ar vaisinių muselių (apie 20 tūkst.), o tam tikrų augalų ir tam tikrų vienaląsčių protistų genomas yra didesnis už žmogaus.

Panašūs faktai kelia klausimą, kas lemia aukštesniųjų organizmų sudėtingumą? Visuminės baltymų analizės arba proteomikos tyrimų technologijos padėjo atskleisti, kad tai – ne genų skaičius, o nepaprastai didelė baltymų struktūrų ir funkcijų įvairovė. Baltymo veikla gali priklausyti ne tik nuo to, koks genas jį koduoja, kokia jo aminorūgščių seka ir tretinė struktūra. Žinių apie tam tikro baltymo geną nekanka suprasti, kas lemia baltymo antrinių izoformų susidarymą, vietą ląstelėje arba aktyvumą. Ląstelei tam tikrais atvejais gali būti lemtingi labai nedidelės baltymo molekulių  dalies (1 proc.) modifikacijos, dėl kurių atsiranda nedaug, bet savitų savybių ir aktyvumų turinčių molekulių.

Dar mokykloje išmokstama, kad baltymus sudaro apie 20 svarbiausių amnorūgščių, kurios turi baigtinį skaičių funkcinių grupių (karboksi-, amino-, hidroksi-, merkapto-, guanidin, alkil-, fenil- ir kelios kitos grupės). Žinome, kad baltymo amino rūgščių seką lemia atitinkamos baltymo geno nukleotidų sekos. Tačiau ląstelėje beveik visi baltymai po sintezės arba net jos metu yra modifikuojami. Todėl jų struktūroje atsiranda įvairūs DNR nekoduojami pokyčiai.  Posttransliacine baltymų modifikacija (PTM) vadinamas struktūrinio baltymo geno nekoduojamas cheminės baltymo struktūros pokytis. Tai gali būti savita dalinė baltymo proteolizė, tam tikrų funkcinių grupių šalinimas arba papildomų funkcinių grupių prijungimas kovalentiniu ryšiu prie baltymo aminorūgščių funkcinių grupių. Tai didina to paties geno koduojamų galimų molekulinių struktūrų skaičių.

Dažnai PTM įvyksta po to, kai susintetinama visa baltymo molekulė. Tada pavadinimas PTM atitinka reiškinio prasmę. Prie tokių modifikacijų galima priskirti baltymų fosforilinimą arba dalinę baltymo pirmtako (pvz., zimogenų) proteolizę, kurios metu baltymas įgauna biologinį aktyvumą. Kitos modifikacijos vadinamos kotransliacinėmis, nes gali vykti dar baltymo sintezės metu – pavyzdžiui, endoplazminio tinklo baltymų glikozilinimas. Tačiau tarp mokslininkų įprasta PTM terminu apibūdinti visas baltymų modifikacijos, kurios nėra koduojamos genų. PTM negalima numatyti, nuskaičius geno nukleotidų seką, ir ši savybė yra bendra tiek post-transliacinėms, tiek kotransliacinėms modifikacijoms. Svarbu tai, kad PTM lemia baltymo fizikinių savybių pokyčius – keičia baltymo molekulinę masę, gali keisti krūvį, elektroforetinį judrumą, sąveikas su kitomis molekulėmis. Dažnai PTM buvimas keičia baltymo vietą ląstelėje, stabilumą ir funkcijas – biologinį aktyvumą (1 lentelė).

 

1 lentelė. PTM atmainos ir poveikis  

PTM atmaina

Reakcijos pobūdis

Pavyzdžiai

Dalinė proteolizė

Peptidinių ryšių hidrolizė

Ko- arba posttransliacinis iniciacijos metionino šalinimas nuo baltymo N galo;

Endoplazminio tiklo baltymų signalo sekos pašalinimas

Proteolizinis probaltymų brendimas: proinsulino vidinio C peptido pašalinimas; baltyminių domenų-slopiklių šalinimas; polibaltymų hidrolizė į aktyvius baltymus, inteinų iškirpimas 

Galinių grupių modifika-cija

N galo aminorūgšties acetilinimas

Mažina baltymo apyvartos greitį: citoplazminių baltymų N galo aminorūgšties acetilinimas

N galo aminorūgšties acilinimas

Susieja baltymą su membrana: baltymų N galo aminorūgšties acilinimas, pvz. Ras miristoilinimas,  

Mažų pakaitų reakcijos

Nuolatinė šoninių funkcinių grupių modifikacija

Keičia baltymų funkcijas:

Kolageno prolino hidroksilinimas stabilizuoja tretinę baltymo struktūrą; hormonų tirozino sulfatacija; tiroglobulino jodinimas, protrombino glutamino g-karboksilinimas

Vidu- arba tarpmolekulinių disulfidiniai tilteliai

Lemia insulino, imunoglobulinų ir kitų ląstelės išorės baltymų tretinę struktūrą ir funkcijas. Tik endoplazminio tinklo baltymai turi disulfidinių tiltelių, citoplazmoje sintezuotuose baltymuose jų nėra.

Grįžtama šoninių funkcinių grupių modifikacija

Valdo fermentų aktyvumą:

Receptorių tirozino kinazių ir Cdk Tyr, Ser, Thre fosforilinimas; Metilinimas – daugeliu atveju funkcija nežinoma; histonų Lys acetilinimas valdo įtaką chromatino struktūrai

Didelių pakaitų reakcijos

Didelių cheminių grupių prijungimas, veikiantis baltymo funkcijas

Būtinų fermentų aktyvumui nukleotidų prijungimas:

pvz., E.coli glutamato sintazės adenilinimas; eukariotų citoplazmos baltymų Ser ar Thre  N-acetilgliukozilinimas; hemų prijungimas prie citochromų; poliADPribozilinimas keičia sąveikas su DNR ir kitais baltymais.

 

Didelių cheminių grupių prijungimas, keičiantis baltymo vietą ląstelėje

Cys acilinimas nukreipia baltymus prie membranos; GPI inkaro prijungimas sujungia baltymus su membranos paviršiumi; Endoplazminio tinklo baltymų Asp N-glikozilinimas nukreipia į sekrecinį kelią; baltymų ubilkvitilinimas nukreipia suardymui 26S proteosomoje;  

Geriausiai ištirta PTM yra baltymų fosforilinimas. Sunku trumpai apibūdinti, kokį sudėtingą ląstelės vidaus signalo perdavimo molekulinį mechanizmą, daugybines kaskadiniu principu veikiančias baltymų kinazių ir fosfatazių sistemas tyrėjams atvėrė gilinimasis į šią temą... Ji dar nėra išsemta, tačiau vien fosforilinimo pavyzdžiu galima iliustruoti, kiek ląstelės vyksmų vienu metu galima valdyti prijungiant prie baltymo molekulės arba pašalinant iš jos vieną gana paprastą cheminę grupę.

Pradiniu tyrimų etapu buvo įsivaizduojama, kad linijinėje baltymo molekulėje gali būti viena PTM, pavyzdžiui fosforilinė, grupė. Vėliau įsitikinta, kad fosforilinės grupės gali būti prijungtos prie daugiau kaip vienos baltymo molekulės vietos, ir padariniai priklauso nuo to, kurios ir kiek iš galimų vietų yra modifikuotos. Pavyzdžiui baltymas p53 turi net 18 galimų fosforilinimo vietų.

Suvokimui apie PTM sudėtingumą plečiantis, paaiškėjo,  kad vienu metu prie baltymo molekulės jungtis nevienodos cheminės grupės. Pabandykime išvardinti bent dešimt galimų modifikacijų – acetilinimas, oksidacija, glutationilinimas, acilinimas, ADP-ribozilinimas, ubikvitilinimas, O- ir N-glikozilinimas, nitrozilinimas, deamidinimas. Galimos skirtingo ilgio polimerinės modifikacijos (ubikvitilinimas, ADP-ribozilinimas), kurios gali būti ir heterooligomerinės (glikozilinimas). Kaip matome 1 pav., vienas baltymas gali būti modifikuotas vienu metu keliais skirtingais būdais. Tai reiškia, kad ląstelėje gali egzistuoti dauginės vieno baltymo subpopuliacijos, kurių masė ir krūvis skiriasi. Todėl skirstant dvikryptės elektroforezės būdu vieno geno produktas (baltymas) gali sudaryti daug dėmių. 

1 pav. PTM įtaka baltymo subpopuliacijų susidarymui ir baltymų funkcijoms ląstelėje. Baltymo aminorūgščių grandinė pavaizduota mėlyna linija, kovalentinės modifikacijos – skirtingos spalvos ir formos priedų simboliais. 

Dauginių vieno baltymo subpopuliacijų buvimas ypač būdingas sudėtingesnėms eukariotų ląstelėms. Baltymo subpopuliacijos molekulių gali būti daug mažiau, lyginant su bendru baltymo kiekiu  arba lyginant su nemodifikuoto baltymo kiekiu (sudaryti mažiau kaip 0,1 proc.). Tačiau jeigu tokiam baltymui būdingos reguliacinės funkcijos, kelios aktyvios jo molekulės gali turėti lemiamos įtakos ląstelės vyksmams. O dabar „vaizdelį“ papildykime tuo, kad PTM yra nestabilios. Todėl baltymo subpopuliacijų deriniai kinta laike ir erdvėje, priklausomai nuo ląstelės gaunamų ir iš jos perduodamų signalų.

Ligų priežastis gali būti ne baltymų mutacijos, bet sudėtingų ir subtilių PTM persitvarkymų sutrikimai. Tam tikri baltymų PTM variantai gali būti ligų žymenimis arba terapinio poveikio taikiniais. Normaliems fiziologiniams vyksmams būdingos tipinės modifikacijos, kitos iš jų susijusios su pažeidimais arba senėjimu (pavyzdžiui, oksidacinės baltymų pažaidos).

Labai nedaug žinoma savaiminių, fermentų nekalizuojamų PTM (pavyzdžiui, redukuotų funkcinių grupių oksidacija deguonies aplinkoje). Kita svarbi daugelio PTM savybė yra jų grįžtamumas. Tai reiškia, kad kartu su modifikuojančiais fermentais veikia ir fermentai, kurie šalina modifikaciją ir atkuria pradinę baltymo formą. Pavyzdžiui, baltymų kinazės veikia kartu su fosfobaltymų fosfatazėmis, baltymų acetilazės – su baltymų deacetilazėmis, ubikvitilinantys fermentai – su deubikvitilinimo fermentais. Tai įgalina tiksliau valdyti dinaminę pusiausvyrą tarp modifikuotų ir nemodifikuotų baltymo formų, vėl atkurti prieš signalo atsaką sukeliant buvusią ląstelės būseną, kad ji būtų pajėgi atsakyti į naują signalą. 

Galime apibendrinti, kad baltymų PTM gali būti:

•         Savaiminės/nesavaiminės;

•         Nesavitos/savitos

•         Grįžtamos/negrįžtamos

•         Grįžtamų PTM susidarymą/šalinimą katalizuoja fermentų šeimų “poros”, pvz.:

             baltymų kinazės/fosfobaltymų fosfatazės,

             baltymų acetilazės/baltymų deacetilazės,

             ubikvitilinantys fermentai/deubikvitilinimo fermentai.

•         Daugybinės “multi-” (baltymas p53 turi 18 galimų fosforilinimo vietų);

•         Daugybinės “poli-” (vienas baltymas gali būti modifikuotas keliais skirtingais būdais);

•         Monomerinės/polimerinės (mono ADP ribozilinimas/poliADP ribozilinimas; glikozilinimas, ubikvitilinimas)

•         Nestabilios, dinamiškos, daugybinių PTM formų pasiskirstymas kinta laike

•         Būdingas mažas santykinis modifikuotų baltymų subpopuliacijos kiekis mažiau kaip 0,1 proc.), lyginant su nemodifikuotais

 PTM reiškinys puikiai iliustruoja vadinamosios pogenominės eros teiginį, kad genomo nuskaitymas yra tik genomo realizavimo tyrimų pradžia. Sudėtingas genominės informacijos įgyvendinimo kelio tyrimas yra proteomikos tyrimų objektas. Viena iš proteomikos atšakų angliškai vadinama posttranslatomics. Nelengva rasti lietuvišką atitikmenį... Bet kuriuo atveju, jau aišku, kad siekiant suprasti, kaip PTM sukelti pokyčiai veikia baltymų funkcijas, gali tekti atlikti gerokai daugiau ir sudėtingesnių tyrimų, nei nuskaitant genomą...

PTM yra vienas iš įrankių, gamtos pritaikytų sudėtingesnių organizmų genomui taupyti. Vieno geno koduojamas baltymas, turintis tam tikrą aminorūgščių seką, priklausomai nuo PTM derinio gali atlikti daug skirtingų funkcijų, panašiai kaip teatro scenoje vienas žmogus, keisdamas makiažą, gali atlikti pačių įvairiausių personažų vaidmenis. Vienodos amnorūgščių sekos baltymo molekulių ląstelėje gali būti daug, tačiau jos gali pasidalinti į PTM subpopuliacijas, kurios tuo pačiu metu atlieka daug skirtingų funkcijų.             

Naujausi literatūros šaltiniai teigia, kad metu jau yra žinoma daugiau kaip 300 PTM atmainų. Svarbiausios iš jų išvardytos  2 lentelėje.

                        2 lentelė. Svarbiausios baltymų posttransliacinės modifikacijos

Modifikaci-jos tipas

Modifikacija

Modifikuoja

aminorūgštį

Jungiamos 1 grupės masė

 Savybės, poveikis

Acetilinimas

Acetilinimas

S (N galo), K

42,04

N-galo negrįžtama, K – grįžtama. Didina baltymų stabilumą, apsaugo jų N galą. Veikia sąveiką su DNR, kitais baltymais, keičia aktyvumą.

Acilinimas

Farnezilinimas

C

204,36

Grįžtama, veikia baltymų ir membranų, baltymų-baltymų sąveikas, lemia vietą ląstelėje

Miristoilinimas

G,K

210,36

Palmitoilinimas

C (S,T,K)

238,41

ADP-ribozilinimas

Mono-ADP-ribozilinimas

 

500

 

Poli-ADP-ribozilinimas

 

10 000

 

Cys oksidacija

Disulfidinio ryšio

C

-2

Grįžtama, oksidacinis valdymas

Glutationilinimas

C

305,31

Sulfeno rūgštis

C

16

Sulfino rūgštis

C

32

Deamidinimas

 

N,Q

1

Valdo baltymų-ligandų ir baltymų-baltymų sąveikas

Fosforilinimas

 

Y,S,T,H,D

79,98

Grįžtama, veikia baltymų aktyvumą, signalo perdavimą

Glikozilinimas

O-glikozilinimas

S,T

>800

Grįžtama, veikia ląstelių sąveiką, sudaro atpažinimo signalus, valdo baltymų aktyvumą, lemia sekreciją

O-Glc-Nac

 

203,2

N-glikozilinimas

N

>800

Metilinimas

monometilinimas

K

14,03

Genų raiškos valdymas, baltymų stabilumas

Dimetilinimas

K

28,05

Trimetilinimas

K

42,08

Nitrinimas

 

Y

45,0

Oksidacinis pažeidimas

S-Nitrozilinimas

 

C

29

Oksidacinis pažeidimas uždegimų metu

Ubikvitilinimas

 

K

>1000

Skaidymo signalas.

Sumoilinimas

 

K

 

 

Hidroksiprolinas

 

 

+16

Didina stabilumą, keičia baltymų sąveikas

Piroglutamo rūgštis

 

 

-17

Didina stabilumą, blokuoja N galą

 

Viename straipsnelyje neįmanoma aprašyti visų PTM. Trumpai apibūdinsime penkias baltymų PTM – fosforilinimą, acetilinimą, glikozilinimą, ADP-ribozilinimą ir ubikvitilinimą.

 

  Baltymų fosforilinimas

Baltymų fosforilinimas yra vienu iš labai svarbių reguliacinių ląstelės vidaus signalo perdavimo mechanizmų. Baltymų fosforilinimas svarbus esminiams biologiniams vyksmams – genų raiškai, ląstelės ciklui valdyti. Fosforilinimo sutrikimai yra dažna vėžinių susirgimų priežastis. Daugelis hormonų ir kitų ląsteles veikiančių veiksnių sukelia savitų baltymų, fosforilinančių daugelį kitų baltymų, aktyvumo pokyčius.

1906 m. P.A. Levene nustatė fosfatą baltymo vitelino (fosvitino) molekulėje, 1933 m. –  fosfoseriną  kazeino molekulėje (kartu su F. Lipmann). Tik po 20 metų E. P. Kennedy aprašė fermentinį baltymų fosforilinimą. 1992 metų Nobelio Medicinos Premija buvo suteikta amerikiečių biochemikams Edmondui Fisheriui (Edmond Fischer) ir Edvinui Krebsui (Edwin Krebs) už grįžtamo baltymų fosforilinimo fermentų tyrimus. Fosforilinimo tyrimų intensyvumą apibūdina faktas, kad 2008 vasario mėn. Medline duomenų bazė nurodo 148 000 straipsnių šia tema.

Fermentai, fosforilinantys baltymus, vadinami baltymų kinazėmis (angl. k. – protein kinases). Mielių genome yra 120 baltymų kinazių ir 40 fosfobaltymų fosfatazių. Žmogaus genomas koduoja apie 500 baltymų kinazių – tai viena iš didžiausių baltymų šeimų. Jų substratai, arba fosforilinami baltymai, sudaro 1/3 visų ląstelės baltymų. Baltymų fosfatazių genų žmogaus genome yra apie 100. Fosforilinami gali būti labai įvairūs baltymai – fermentai, receptoriai, transkripcijos veiksniai. Apskaičiuota, kad žmogaus proteomoje yra daugiau kaip 100 000 potencialių fosforilinimo vietų.

Baltymų kinazės perkelia galinę ATP fosfato grupę ant Ser, Thre ar Tyr grupių baltymuose-substratuose. Prokariotams būdingesnis His, Asp, Glu fosforilinimas. Dažniausiai fosforilinamos 1-3 specifinės baltymų aminorūgščių liekanos (2 pav.):

                2 pav. Baltymų fosforilinimą katalizuoja baltymų kinazės

 

Modifikacija sukelia baltymų konformacijos pokytį, nes padidina modifikuojamos molekulės dalies hidrofiliškumą, suteikia jai neigiamą krūvį. Dėl konformacijos pokyčio baltymai įgauna arba praranda tam tikrą aktyvumą („įjungiami“ arba „išjungiami“). Tai gali būti fermentinis aktyvumas, sąveika su kitais baltymais, DNR, ląstelės griaučiais ir pan.

Sunku būtų rasti ląstelės gyvybinių vyksmų, kuriems baltymų fosforilinimas neturėtų įtakos. Ląstelės ciklas, diferenciacija, apoptozė, medžiagų apykaitos valdymas yra vieni iš svarbiausių pavyzdžių. Baltymų fosforilinimo būdu valdomi svarbiausi medžiagų apykaitos ir signalo perdavimo keliai,   energijos panaudojimo reakcijos, pvz.,  Na+/K+-ATPazė (osmoreguliacija), baltymų-baltymų sąveika, nes fosforilinimas keičia atpažinimo domenų konformaciją. Be to, fosforilinimas svarbus ir baltymų skaidymui – tam tikri baltymai tampa ubikvitino ligazės substratais tik fosforilintos formos).

 

Ląstelės išorės signalus dažnai perduoda nuo cAMP priklausanti baltymų kinazė, vadinama baltymų kinaze A. Aktyvi jos forma katalizuoja nuo Mg2+ priklausomą baltymų sekų -Arg-Arg-X-Ser irLys-Arg-X-X-Ser- fosforilinimą. Kitas baltymų kinazės aktyvina Ca2+ jonai (baltymų kinazė C), ciklinis GMP (baltymų kinazė G) ir kiti antriniai signalo tarpininkai.

Kita hormonų poveikį reguliuojančių fermentų klasė yra fosfobaltymų fosfatazės. Jos atlieka fosforilintų baltymų defosforilinimo reakcijas (3 pav.).

3 pav. Baltymų kinazės ir fosfatazės katalizuoja baltymų fosforilinimo–defosforilinimo ciklus

 

Fosfobaltymų fosfatazių aktyvumas yra valdomas posttranskripcinių modifikacijų (fosforilinimas/ defosforilinimas, metilinimas), veikiant antriniams signalo tarpininkams (Ca2+/kalmodulinu, cAMP); sąveika su reguliaciniais baltymais ir baltymais-slopikliais. Žinomos dešimtys fosfobaltymų fosfatazių, savitai šalinančių fosfato grupes nuo fosforilintų baltymų. Jų kataliziniai subvienetai susiję su įvairiais reguliaciniais subvienetais, kurie gali lemti substratinį savitumą, t.y., baltymus taikinius.

Fosforilinimo būdu grįžtamai moduliuojamas katalizinis svarbių medžiagų apykaitos fermentų aktyvumas. Fermentai, kurių aktyvumas keičiamas grįžtamos kovalentinės modifikacijos būdu, vadinami ,,interconvertable" – konvertuojamais arba tarpusavyje kaitomais. Jiems būdingos dvi formos - mažo ir didelio aktyvumo. Modifikuojant viena forma virsta kita. Tam tikrų fermentų aktyvi forma fosforilinta, kitų - atvirkščiai.

 

3 lentelė. Konvertuojamų fermentų aktyvumo priklausomybė nuo fosforilinimo

Fermentai, aktyvūs Pi būsenos

Fermentai, aktyvūs dePi būsenos

Glikogenfosforilazė

Citrato liazė

PDH-kinazės

fosforilazės b kinazė

HMG-CoA reduktazė

Glikogeno sintetazė

acetilKoA karboksilazė

HMG reduktazė

Piruvato dehidrogenazė

 

Konvertuojantieji fermentai – baltymų kinazės ir fosfobaltymų fosfatazės dažnai patys yra konvertuojami (ypač kinazės) ir griežtai valdomi. Baltymų fosforilinimo ir defosforilinimo nuoseklios sekos vadinamos fosforilinimo kaskadomis. Hormonai gliukagonas ir epinefrinas sukelia cAMP koncentracijos ląstelėje didėjimą ir todėl  aktyvina glikogenolizę (aktyvina fosforilazės kinazę ir slopina fosfatazę). Kaskada įgalina sustiprinti mažą pradinį hormono signalą – 10-10 M epinefrino sukelia 50% gliukozės koncentracijos padidėjimą kraujyje. Insulinas turi priešingą poveikį, nes veikdamas per antrinį signalo tarpininką ir kinazes jis aktyvina fosfobaltymų fosfatazes.

Šiuo metu gerai ištirtos ląstelės paviršiaus receptorinės tirozino kinazės ir jų veikimo mechanizmas. Šie receptoriai autofosforilinimo ir fosforilinimo būdu perduoda į ląstelę peptidinių augimo veiksnių, citokinų, hormonų poveikį. Žinoma net 90 žmogaus tirozino kinazių genų, kurios sudaro XVII šeimų.   Mitogenų aktyvinamų baltymų kinazių (MAPK kinazių) signalo perdavimo kelias valdo genų raišką, ląstelės ciklą, diferenciaciją, apoptozę. Jų žinomos šešios šeimos. Žinomi ir kiti signalo perdavimo keliai, kurie kaip taisyklė dažnai yra susiję vieni su kitais, sąveikauja priklausomai nuo ląstelės konteksto.

Atsižvelgiant į baltymų kinazių ir fosfatazių katalizuojamų PTM svarbą lątelės vyksmams, vyrauja nuomonė, kad ląstelės gyvybinių procesų ir jų valdymo supratimas yra neįmanomas be fosfoproteomos tyrimų, t.y., be fosfobaltymų katalogo sudarymo. Šis katalogas reiškia, kad nustatomas visų tam tikros ląstelės galimų fosforilinimo vietų pasiskirstymas, įvertinama alternatyvių baltymų fosfoformų gausa ir jos kitimų dinamika priklausomai nuo sąlygų.  Adekvatūs tyrimo metodai buvo sukurti visai neseniai, pasiūlius fosfobaltymų formų koncentravimo technologijas.      

 

Baltymų acetilinimas

Fermentai baltymų acetilazės perkelia acetilgrupes nuo acetil-KoA molekulės baltymų substratų N galo aminogrupėms arba savitoms vidinės baltymo molekulės dalies lizino e–aminogrupėms. Baltymų acetilazių substratai yra labai įvairūs baltymai. Dažnai jie skirstomi į histonus ir nehistoninius baltymus.

N galo acetilinimas yra negrįžtamas, skirtingai nuo grįžtamo lizino e–aminogrupių acetilinimo. Kotransliacinis N-galo acetilinimas būdingas net apie 85% eukariotų baltymų, tačiau retas prokariotų ląstelėse. Tam tikrais atvejais N galo acetilinimas didina baltymų aktyvumą (pavyzdžiui, 50 kartų didina augimo hormoną paleidžiančio veiksnio veiksmingumą), kitais atvejais – mažina (pavyzdžiui, b-endorfino).

Posttransliacinis vidinių baltymo molekulės lizinų acetilinimas būdingas prokariotų ribosomų baltymams ir subrendusiems eukariotų reguliaciniams peptidams. Posttransliaciniu būdu acetilinamas histonų, didelio judrumo grupės baltymų, transkripcijos veiksnių, branduolio receptorių ir a-tubulino lizino e–aminogrupės. Acetilintas lizinas netenka teigiamo krūvio, tai keičia baltymų fermentinį aktyvumą, stabilumą, sąveiką su DNR, kitais baltymais (4 pav.).

 

4 pav. Baltymų acetilinimas  lemia baltymų elektrostatinių sąveikų pokyčius

 

Kotransliacinis eukariotinių ląstelių baltymų N galo acetilinimas įvyksta, pradinei 20-50 aminorūgščių ilgio ribosomos sintetinamo baltymo grandinei pasirodžius iš ribosomos plyšio. Nepavyko nustatyti tam tikros savitos acetilinimą lemiančios signalo sekos, nors dažnai acetilinamų baltymų N gale yra daug serino ir alanino. Greičiausiai tai paaiškinama didelio skaičiaus skirtingo savitumo N-acetiltransferazių buvimu. Mielių N-acetiltransferazių mutantai yra gyvybingi, tai reiškia, kad šių fermentų aktyvumas nėra gyvybiškai svarbus.

Baltymų acetilinimas valdo chromatino struktūrą ir transkripcijos aktyvumą. Daugeliui transkripcijos koaktyviklių būdingas baltymų acetilazės aktyvumas, korepresoriams – baltymų deacetilazės aktyvumas. Histonų hiperacetilinimas (histonų acetiltransferazės, HAT) susijęs su transripcijos aktyvinimu, histonų deacetilinimas (histonų deacetilazės, HDAC) – su transkripcijos represija. Žinoma 18 žinduolių histonų deacetilazių (HDAC). HDAC skirstomos į 3 klases:

·        I klasės HDAC (1, 2, 3 ir  8);

·        II klasės HDAC (4, 5, 6, 7, 9 ir 10);

·        III klasės HDAC – sirtuinai.

III klasės HDAC yra NAD+ priklausomos baltymų deacetilazės, vadinamos sirtuinais, SIR (silent information regulator). Šių fermentų aktyvumas nustatytas bakterijų, augalų, gyvūnų ląstelėse. Sirtuinai: 1. šalina acetilgrupes nuo histonų slopindami tam tikrų genų raišką; 2. inhibuoja acetilCoA sintetazę  šalindami acetilgrupę iš aktyviojo centro. Taigi, baltymų acetilinimo laipsnis priklauso nuo pusiausvyros tarp baltymų acetilazių ir deacetilazių aktyvumo.

Histonų acetilinimas keičia chromatino struktūrą, silpnina histonų-DNR sąveiką, didina DNR prieinamumą transkripcijos aktyvacijos kompleksams, kurių baltymai turi su acetillizinu susijungiančius bromodomenus. Histonų hipoacetilinimas yra būdingas tylinčioms heterochromatino sritims (5 pav.).

Savitas nehistoninių baltymų acetilinimas (pvz., p53, E2F) keičia jų aktyvumą, vietą, sąveikas, stabilumą.

5 pav. Histonų acetilinimas turi įtakos chromatino kompaktiškumui    

 

Reguliacinės baltymų acetilinimo funkcijos labai plačios, šiuo būdu valdomi vyksmai:

•         transkripcija,

•         proliferacija,

•         diferenciacija,

•         apoptozė,

•         imuninės sistemos aktyvumas,

•         cirkadiniai ritmai,

•         atmintis.

Svarbu ir tai, kad baltymų acetilinimo sistema yra potencialus vaistų taikinys tam tikrų ligų atvejais.

Baltymų glikozilinimas

Baltymų glikozilinimas susidarant glikozilintiems baltymams arba glikobaltymams, yra endoplazminio tinklo ir Goldžio komplekso baltymams būdinga PTM. Reakcijas, kurių metu prie baltymo aminorūgščių radikalų jungiamos sacharidinės molekulės (oligosacharidai arba glikanai), katalizuoja fermentai glikoziltransferazės. Net apie 50% eukariotų baltymų yra glikozilinti. Didžioji dauguma glikobaltymų yra sekrecinės sistemos baltymai, kiti – endoplazminio tinklo, Goldžio komplekso, lizosomų ir plazminės membranos baltymai.  Esminis glikozilintų baltymų sacharidinės dalies skirtumas nuo homomerinių atsargos ir struktūrinių polisacharidų (glikogeno, krakmolo, celiuliozės) yra tai, kad jie yra informacinės molekulės. Šie oligosacharidai sudaryti iš įvairių monomerų, kurių seka, skaičius ir grandinės šakotumo pobūdis nėra atsitiktiniai, tačiau tiksliai užprogramuoti ir prasmingi, panašiai kaip nukleotidų seka nukleorūgščių arba aminorūgščių seka baltymų molekulėse.  

Žinomos trys svarbiausios baltymų glikozilinimo atmainos:

·        N-glikozilinamas;

·        O-glikozilinamas;

·        Glikozilfosfatidilinozitolio (GPI) inkaro prijungimas (6 pav.).

 

6 pav. GPI inkaru dažniausiai prie plazminės ląstelės membranos išorės kovalentiškai jungiami periferiniai baltymai.

 

Baltymai N-glikozilinami, kai oligosacharidas jungiamas prie baltymų Asp -NH2 grupės, arba O-glikozilinami, kai tai vyksta per Ser-OH ar Thr-OH grupes (7 pav.). Tokia modifikacija keičia baltymų tretinę struktūrą ir savybes: stabilumą, tirpumą, poliškumą, sąveiką su membranomis, fizinį dydį. Prie baltymo prisiūta oligosacharidinė dalis yra tolesnio jų atpažinimo signalas kitiems baltymams ar ląstelėms.

 

 

7 pav. Baltymų N-glikozilinimo (a) ir O-glikozilinimo (b) metu susidarantys glikozidiniai ryšiai.

 

Žinoma apie 100 glikoziltransferazių (priklausančių 7 klasėms), pasižyminčiu trejopu specifiškumu:

a)    prijungiamam sacharidui, nes susidaręs oligosacharidas turi įvairią monomerų sudėtį (ET dažniausiai prijungiami N-acetil-gliukozaminas, manozė, gliukozė);

b)   baltymui-substratui;

c)    sudaromų ryšių konfigūracijai.

 

N-glikozilinimas būdingas tik eukariotams. Jis vyksta endoplazminiame tinkle ir yra kotransliacinis. Tai savita eukariotų kovalentinė baltymų modifikacija, būtina jų paskirstymui įvairiose organelėse. O-glikozilinimas dažniau potransliacinis ir vyksta Goldži komplekse, kur modifikuojami jau pilnai susiformavę baltymai. O- ir N-glikozilinimo metu prisiuvamų oligosacharidų sudėtis skiriasi. GPI inkaras yra prijungiamas prie  baltymo C galo, pašalinus C galo signalo seką.

N-glikozilinimo metu prie endoplazminio tinklo baltymų specifinių sekų jungiamas iki 14 įvairių sacharidų žiedų savitas oligosacharidas, kuris prasideda N-acetilgliukozaminu (GlcNAc) (8 pav.). Dažniausiai jis turi kelias šakas, į kurias įjungiama daug manozės ir GlcNAc, o šakų galuose yra neigiamai įkrautos sialo rūgšties (NANA) grupės – Glc3Man9(GlcNAc)2. Tokios sudėties oligosacharidas būdingas augalų, protistų ir gyvūnų endoplazminiam tinklui.

Tai įvyksta dar transliacijos metu (kotransliacinė modifikacija), katalizuojant endoplazminio tinklo membranoje esančioms. Šie fermentai specifiškai atpažįsta sekas -Asn-X-X-X-Ser- ir Asn-X-Thr. Kiekvienai ląstelei būdingas glikoziltransferazių rinkinys lemia savitą glikoproteinų oligosacharidinės dalies (turinčios informacinio polimero funkciją) sudėtį. Tam tikros grandinės labai sudėtingos. Jų augimas sustoja, kai nėra atitinkamo savitumo glikoziltransferazių. Oligosacharidinė glikoproteinų žymė toliau modifikuojama glikozidazių, kurių funkcija yra nukreipti baltymus į Goldžio kompleksą. Trijų gliukozės grandžių prisiuvimas endoplazminio tinklo oligosacharido dariniui yra žymė, leidžianti baltymui toliau keliauti į Goldžio kompleksą.

 

8 pav. N-glikozilintų baltymų oligosacharidinių grandinių tipai, susidarantys po nuoseklių baltymų modifikacijų endoplazminiame tinkle ir Goldžio komplekse. Man – manozė, Gal – galaktozė, Fuc – fukozė, GlcNac – N-acetilgliukozaminas, Asn – asparaginas.

 

Goldžio komplekse baltymų N-oligosacharidinė grandinė keičiama O-glikozilinimo būdu, taip kad susidaro savitas kiekvienam baltymui oligosacharidų darinys, kuris tampa informacine molekule. Tokios oligosacharidų grandinės lemia plazminės membranos baltymų imunogenines sąvybes, kraujo grupes, svarbios ląstelių atpažinimo ir adhezijos procesams. O-glikozilinimui būdingos trumpos 1-4 sacharidų grandinės, kurios susidaro, glikoziltransferazėms jungiant po vieną monomerą. Į glikobaltymų oligosacharidų sudėtį gali įeiti net 30 skirtingų sacharidinių monomerų. Tokiu būdu susidaro labai didelė oligosacharidinių dalių įvairovė. Atsižvelgiant į grandinių sudėtį, skiriamos tris jų atmainos: (i) daug manozės turinčios; (ii) hibridinės ir (iii) sudėtingos (8 pav.). O-glikozilintiems baltymams būdinga daug didesnė grandinių tipų įvairovė (9 pav.).

Cis-Goldžio tinkle fosforilinami lizosominių baltymų oligosacharidai. Goldžio komplekso cis-cisternose N-oligosacharidui Glc3Man8(GlcNAc)2 pirmiausiai pašalinamos trys Glc grandys, po to šakos dar sutrumpinamos, hidrolizuojant 3 manozės grandis – susidaro Man5(GlcNAc)2. Taip pažymėti baltymai pereina į medialinę Goldžio komplekso dalį, kurioje po 4 nuoseklių modifikacijos reakcijų oligosacharide lieka tik 3 manozės, kurių kiekviena esterifikuota GlcNAc. Atšakos pagrinde esantis GlcNac glikozilinamas fukoze. Trans-cisternose prie šakų galų jungiamos galaktozės ir NANA grandys. Trans-Goldžio tinkle prie sacharidų ir baltymų tirozino grupių jungiamos sulfogrupės -OSO3H. Neuronų adhezijos baltymui prisiuvama polisialo rūgštis. Glikoproteininiai hormonai žymimi specifinio glikozilinimo ir sulfoninimo reakcijomis ir nukreipiami į saugojimo granules, kuriose koncentruojami ir saugomi.

 

9 pav. O-glikozilintų baltymų oligosacharidinių grandinių tipai (pavaizduota tik struktūros šerdis). Gal – galaktozė, GlcNac – N-acetilgliukozaminas, GalNac – N-acetilgalaktozilaminas, Ser/Thr – serinas arba treoninas.

 

Goldžio komplekso baltymų modifikacijos skirtingos augalų, žinduolių, mielių ir vabzdžių ląstelėse. Bakterijoms baltymų N-glikozilinimas nebūdingas, todėl tam tikrais atvejais juose sintezuojamų rekombinacinių baltymų aktyvumas gali būti nepakankamas, jeigu jų biologiškai aktyviai konformacijai sudaryti būtinas glikozilinimas.

4 lentelė. Glikozilintų baltymų funkcijos

Funkcija

Glikoproteinas

Struktūrinės molekulės

Kolagenas

Lubrikantai/apsauginės molekulės

Mucinai

Pernašos baltymai

Transferinas, ceruloplazminas

Imuninės sistemos baltymai

Imunoglobinai

Audinių suderinamumo baltymai

Antigenai

Hormonai

Chorioninis gonadotropinas, TSH

Fermentai

Šarminė fosfatazė

Ląstelių sukibimo/atpažinimo baltymai

Baltymai svarbūs ląstelės-ląstelės, ląstelės–viruso, ląstelės –bakterijų sąveikai

Antifrizai

Šaltavandenių žuvų baltymai

Sąveika su savitais sacharidais

Lektinai, selektinai

Receptoriai

Baltymai svarbūs receptorių ir vaistų poveikiui

Baltymų susilankstymas

Kalretikulinas, kalneksinas

Homeostazė ir trombozė

Kraujo kūnelių paviršiaus glikobaltymai

Vystymosi valdymas

Notch baltymai

 

Net to paties organizmo ląstelės baltymams būdingas tam tikras N-glikozilinimo heterogeniškumo laipsnis, tam tikras kiekybinis glikoformų  pasiskirstymas tiek pagal oligosacharidinės dalies sudėtį, tiek pagal glikozilinimo vietą. 

Lyginant baltymų fosforilinimą ir O-glikozilinimą, galima pastebėti, kad abiem atvejais kovalentiškai modifikuojamos baltymų serino ir treonino funkcinės grupės. Tai reiškia, kad šios dvi PTM gali konkuruoti dėl jungimo vietų baltymų molekulėse. Todėl baltymų glikozilinimo ir fosforilinimo laipsnis gali priklausyti nuo dviejų grupių modifikuojančiųjų fermentų (baltymų kinazių/baltymų fosfatazių ir baltymų O-glikoziltranserazių/glikozidazių) aktyvumų ir jų dinaminės pusiausvyros (10 pav.)   

9 pav. O-glikozilintų baltymų grupių kiekis gali priklausyti nuo fosforilintų baltymų grupių kiekio ir atvirkščiai.

           

Greičiausiai, toks reciprokinis dviejų baltymų PTM valdymas suteikia papildomų reguliacinių galimybių ir priklausomybės nuo platesnio veiksnių konteksto, veikiant sudėtingiems ląstelės signalo perdavimo keliams. 

ADP-ribozilinimas

Baltymų ADP ribozilinimas yra dviejų atmainų:

1)      mono ADP-ribozilinimas, kurio metu prie baltymų jungiama viena ADP-ribozės grupė. Reakciją katalizuoja fermentas NAD ADP-riboziltransferazė, kuris ant baltymų nuo NAD+ molekulės perkelia ADP-ribozę. Reakcijos metu susidaro niacinamidas. Ši modifikacija labiau būdinga prokariotams.  Pavyzdžiui, Vibrio cholerae, Clostridium botulinum C3, Bordetelia pertussis; Pseudomonas aeruginossa, Corynebacterium NAD ADP-riboziltransferazės katalizuoja ląstelės šeimininko signalo perdavimo G ir Rho baltymų aminorūgščių ( Arg, Asp, Cys, Ser, Thr) monoADP ribozilinimą [Ziegler M., 2000]. Eukariotų ląstelių NAD ADP-riboziltransferazės aktyvumas būdingas ląstelės išorės baltymams (sekretuojamiems arba GPI inkaro baltymams). 

2)      Baltymų poliADPribozilinimas yra  „sunkiausia“ kovalentinė baltymų modifikacija, būdinga tik eukariotams (išskyrus mieles). Jam vykstant, prie baltymų jungiami linijiniai arba šakoti ADP-ribozės polimerai, į kurių sudėtį įeina iki 200 monomerų (10 pav). Reakciją katalizuoja fermentas poli(ADP-ribozės) sintetazė arba poli(ADP-ribozės) polimerazė (PARP), kuri yra gausiausias branduolio baltymas (kiekvienoje ląstelėje yra iki 1 mln. izoformos PARP1 kopijų). Šiuo metu nustatytos 8 tipų PARP izoformos, žinoma 17 šios šeimos narių. 

 

 

10 pav. Baltymų poliADP-ribozilinimo iniciacijos, polimero grandinės ilginimo ir šakojimosi reakcijas kanalizuoja PARP,  o polimero hidrolizę – poliADPribozės glikohidrolazė, PARG. Paskutinį monomerą nuo polimero pašalina trečias fermentas –ADPribozilbaltymų liazė.

 

Baltymų poli(ADP)ribozilinimo metu susidarantis  poli(ADP)ribozės polimeras gali būti priskiriamas prie trečiojo nukleorūgščių tipo, nes jam būdinga spiralinė struktūra. Šis elektroniniu mikroskopu matomas polimeras vadinamas dygliakiaulės struktūra (11 pav.).

 

11 pav. PoliADPribozės polimero vaizdas elektroniniu mikroskopu

 

 Homopolimeras ADPr: -r-P-P-r(A)-r-P-P-r-(A)-r- prie baltymų jungiamas per Glu g-karboksigrupes. Vieno 200 monomerų ilgio „baltymo papuošalo“ molekulinė masė gali siekti 10 kDa. Tai gali lemti labai didelį baltymo masės pokytį. Be to, vienas baltymas gali turėti kelias modifikacijos vietas. Polimeras turi daug neigiamo krūvio fosforilinių grupių, todėl stipriai keičia baltymų sąveikas su DNR, kitais baltymais ar kitomis ląstelės struktūromis.

PoliADP ribozilinimo poveikis yra baltymo taikinio aktyvumo slopinimas, o biologinė funkcija priklauso nuo taikinio. PARP taikiniai yra labai įvairūs baltymai – pats PARP autoribozilina save, transkripcijos veiksniai, DNR pažaidų taisymo fermentai, histonai, imuninės sistemos baltymai, signalo perdavimo baltymai ir kt.

PARP yra indukuojami fermentai, kurių aktyvumas yra sudėtingai valdomas: viengrandžiai  DNR trūkiai aktyvina  PARP apie ~500 kartų, autoribozilinimas slopina ir silpnina sąveiką su DNR, fosforilinimas (baltymų kinazė C) – slopina; fosfolipazės C - IP3 - Ca2+ signalo kelias aktyvina nepriklausomai nuo  DNR trūkių, niacinamidas ir purinai – slopina.

Baltymų poli ADP-ribozilinimo laipsnį lemia pusiausvyra tarp poliADPribozilinimo ir pADPR polimero hidrolizės. pADPr hidrolizę katalizuoja 111 kDa poli(ADP-ribozės) glikohidrolazė, PARG, kuri hidrolizuoja polimerus ir nuo autofosforilintos PARP, taip atkurdama PARP aktyvumą (12 pav.).

 

12 pav. Baltymų (tarp jų ir PARP) poliADPribozilinimo laipsnis priklauso nuo pusiausvyros tarp PARP ir PARG aktyvumo.

Normaliomis sąlygomis PARG pilnai kompensuoja PARP aktyvumą. Todėl poliADPr polimero gyvavimo puslaikis  yra mažesnis nei 1 min. Tačiau PARP stipriai aktyvinama oksidacinio streso arba genotoksinio pažeidimo sąlygomis atsiradus viengrandžiams DNR trūkiams. Stiprus genotoksinis pažeidimas taip stipriai aktyvina PARP, kad gali sukelti visos ląstelės NAD+ sankaupos sunaudojimą per 15 min. [Yu, 2002]. Teigiama, kad PARP yra dviveidis (Jin ir Jan) ląstelės aktorius: jeigu ląstelės DNR pažaidos nėra labai stiprios, PARP veikia kaip angelas sargas, greitinantis jų taisymą ir padedantis ląstelei išlikti; tačiau jeigu pažaidos yra stiprios, PARP hiperaktyvinimas sukelia energijos krizę ir gerokai paspartina ląstelės mirtį. Tokiais atvejais PARP slopikliai stabdo nekrozę ir nukreipia pragaištingus vyksmus audiniui palankesnio mirties kelio – apoptozės link.  

Biologinių baltymų poliADPribozilinimo funkcijų sąrašas labai platus [Virag, 2005]:

·        PARP vadinamas “angelu sargu”, nes svarbus DNR pažaidų taisymui ir genomo apsaugai.

·        Chromatino remodeliavimas.

·        Replikacijos ir diferenciacijos valdymas. PARP -  replikosomos sandas.

·        Reguliuoja baltymų raišką, nes PARP jungiasi su iRNR. Streso metu aktyvina teisingų iRNR transkripciją

·        PARP reguliuoja  telomerazės aktyvumą.

·        PARP gali ląstelės žūties kelią nukreipti nuo apoptozės į nekrozę.

·        Poli(ADP)r  gali būti naudojamas ATP sintezei.

·        Baltymų (20S proteosomos) poli(ADP)ribozilinimas skatina baltymų skaidymą  oksidacinį streso metu.

·        PARP svarbi  ląstelės griaučių struktūrai (padidinta raiška sutrikdo F-aktino struktūrą).

 

Ubikvitilinimas

Ubikvitilinimu baigsime ši straipsnelį, nes tai yra paskutinė PTM baltymų „gyvenime“, kuri lemia jų suardymą. Savitas eukariotų baltymas ubikvitiną (Ub, angl. k. - ubiquitin) yra baltymų skaidymo žymė. Ub yra pats konservatyviausias (mielių ir žinduolių Ub skiriasi tik 3 aminorūgštim) iš visų žinomų baltymų. Tai mažos molekulinės masės (Mm = 8451) 76 aminorūgščių ilgio baltymas, paplitęs visose eukariotinėse ląstelėse (todėl pavadintas ubikvitinu). Ląstelėje Ub gali būti laisvas arba prisijungęs prie kitų baltymų. Ub prijungimas (ubikvitininimas) yra baltymo “pažymėjimas sunaikinimui”. Prie kitų baltymų Ub jungiasi izopeptidiniu ryšiu: Ub C-galo glicinas grįžtamai ir savitai jungiasi su “žymimo” baltymo Lys-e-NH2 grupe. Vienos Ub molekulės nepakanka skaidymo signalui sudaryti, tai gali būti tik rūšiavimo signalas. Prie skaidymui nukreipiamo baltymo jungiama poli-Ub grandinė (13 pav.), kuri dažnai būna išsišakojusi, tarsi “šluota”.

Susidarant poli-Ub, sekantys Ub monomerai gali būti jungiami prie jau prijungto Ub Lys-e-NH2 grupių, esančių 29, 48 ir 63 padėtyse. Modifikacija pirmose dviejose padėtyse turi skaidymo žymės prasmę, tačiau nuo 63 padėties prasidedanti grandinė lemia kitokį baltymų likimą.

 

13 pav. Baltymų kovalentinė modifikacija ubikvitinu (Ub) yra nukreipimo proteolizei 26S proteosomoje žymė.

 

Sąveika su poli-Ub yra būtina greitai šalinamų baltymų degradacijai. Baltymų poliubikvitilinimą lemia trys fermentai:

·        aktyvinantis fermentas E1 katalizuoja Ub aktyvinimą, prijungiant jį prie fermento E1 tioesterine jungtimi:

·        konjuguojantis fermentas E2 sudaro tioesterinį ryšį su UB: Ub*- E2. Šis fermentas savitai jungia ubikvitiną prie žymimų baltymų Lys-e-NH2 grupės, gali būti ubikvitininamos kelios Lys grupės iš karto.

·        Ub-ligazė E3 lemia savitą  saveiką su baltymu substratu

                          

Substrato pažinimą lemia E2 ir E3 heterodimerai. Prie pirmos Ub grupės jungiamos kitos Ub molekulės, taip formuojama šakota struktūra, kurią atpažįsta 26S proteazė. Kai nuo ATP priklausoma 26S proteazė suardo pažymėtą baltymą, Ub atsilaisvina sekančiam skaidymo ciklui.

           Reguliaciniu požiūriu labai svarbus yra baltymų modifikacijos ubikvitinu grįžtamumas. Susidariusios ant įvairių baltymų poli-Ub grandinės labai dinamiškos, prie jų gali būti greitai pridedamos ar pašalinamos Ub liekanos. Baltymų ubikvitininimo laipsnį lemia sudėtingai reguliuojama pusiausvyra tarp ubikvitininimo ir deubikvitininimo reakcijų. Tai atlieka deubikvitininimo fermentai, kurie keisdami baltymų ubikvitininimo laipsnį, keičia jų skaidymo 26 S proteosomoje tikimybę.

Ub pažymėti seni baltymai prijungiami prie 26S proteosomos 19S komplekso atpažinimo subvieneto, išvyniojami ir pernešami į proteosomos 20S šerdies ertmę, kur yra labai greitai suardomi (14 pav.).

Ypač greitai ubikvitilinami oksiduoti baltymai. Kita vertus, apskaičiuota, kad net apie 30 proc. naujai susintetinamų baltymų yra iš karto suardomi, nes turi struktūros defektų. Svarbiausia ubikvitilinimo savybė yra tai, kad jis užtikrina labai savitą ląstelės vidaus baltymų skaidymą (15 pav.). Baltymų „žymėjimo ubikvitinu“ greitis priklauso nuo tam tikrų jo sekos ypatumų – N galo aminorūgščių sudėties (Varšavskio N galo taisyklė), taip vadinamų PEST arba skaidymo dėžių sekų buvimo. Šie baltymo skaidymą skatinantys jo struktūros elementai vadinami degronais.   

 

 

14 pav. 26S proteosomos rentgenostruktūrinė nuotrauka, modelis ir veikimo schema. Cap – reguliacinis subvienetas, 20S centrinę šerdį sudaro keturi heptameriniai žiedai iš a ir bsubvienetų

 

 

  15 pav. Tirpių mielių baltymų skaidymo greitis yra labai nevienodas (Pratt et al.). 

 

2003 m. Gygi ir autoriai atliko mielių Sach. cerevisiae baltymų ubikvitilinimo tyrimus. Jie sukūrė mielių kamieną, turintį šešis papildomus histidino kodonus turintį ubikvitino geną. Šių mielių ląstelėse vyko N galo histidino „vėliavą“ turinčio ubikvitino raiška. Tyrėjai nustatė daugau kaip 1000 ubikvititilintų baltymų, tiksliai nustatė 110 ubikvitilinimo vietų 72 baltymuose. Tokio pobūdžio tyrimai vadinami ubikvitinomika [Peng, 2008].

 

 

Literatūra:

http://en.wikipedia.org/wiki/Phosphorylation

R.M. Twyman. Principles of Proteomics, 2004, Taylor&Francis group, New York

Yu et al., Science 297, 2002, p. 259.

Pollak N, Dölle C, Ziegler M. Biochem J. 2007 Mar 1;402(2):205-18.

Ziegler M. Eur J Biochem. 2000 Mar;267(6):1550-64.

Berger F, Ramírez-Hernández MH, Ziegler M. Trends Biochem Sci. 2004 Mar;29(3):111-8.

Virág L.  Curr Vasc Pharmacol. 2005 Jul;3(3):209-14.

http://finley.med.harvard.edu/ubiquitin/chapters/Peters_et_al.html

http://www.nottingham.ac.uk/biochemcourses/students/ub/ubindex.html

Peng J. BMB Rep. 2008;41(3):177-83.

Weake VM, Workman JL. Mol Cell. 2008 Mar 28;29(6):653-63.

Teasdale R.D., Jackson M.R. Annu Rev Cell Dev Biol. 1996;12:27-54.

Pratt JM, Petty J, Riba-Garcia I et al.  Mol.Cell. Proteom., 2002, 1, 579-591.

 


Naturales Scientiae Omnibus