Kurkime ateitį drauge!


Prof. habil. dr. Vida Mildažienė, doc. dr. Zita Naučienė

Vytauto Didžiojo universitetas

Baltymų makiažas: posttransliacinės modifikacijos

 

 

Pogenominė era atnešė labai daug naujų atradimų. Paskutiojo dešimtmečio moksliniai tyrimai sugriovė tam tikras iki tol tvirtai galiojusias dogmas ir iš esmės pakeitė supratimą apie gyvybės sudėtingumo laipsnį. Viena iš tokių dogmų buvo visuose vadovėliuose paplitęs aiškinimas apie tai, kad kuo sudėtingesnis organizmas, tuo daugiau genų jis turi. Tačiau nuskaičius žmogaus genomą ir palyginus jame esančių struktūrinių genų skaičių su kitų organizmų rūšių genų skaičiumi, įsitikinta, kad tokia dogma galioja tik lyginant labai tolimose evoliucijos pakopose esančius organizmus – virusus, bakterijas su eukariotais. Tačiau aukštesniųjų eukariotų baltymus koduojančių genų skaičius (20 -30 tūkst.) panašus į   kirmėlių ar vaisinių muselių (apie 20 tūkst.), o tam tikrų augalų ir tam tikrų vienaląsčių protistų genomas didesnis už žmogaus.

Panašūs faktai kelia klausimą, kas, jeigu ne genų skaičius lemia aukštesniųjų organizmų sudėtingumą. Visuminės baltymų analizės arba proteomikos technologijos padėjo atskleisti, kad nepaprastą gyvųjų sistemų sudėtingumą lemia ne genų skaičius, o didelė jų koduojamų baltymų struktūrinė ir funkcinė įvairovė. Žinių apie tam tikro baltymo geną nekanka suprasti kas lemia baltymo antrinių izoformų susidarymą, vietą ląstelėje arba aktyvumą. Baltymų funkcijai svarbios jų posttransliacinės modifikacijos (PTM) , kurių jau yra žinoma daugiau kaip 300 atmainų.

Viena iš geriausiai ištirtų PTM yra baltymų fosforilinimas. Daugeliui iš jūsų yra žinoma, koks sudėtingas yra baltymų fosforilinimo ir defosforilinimo sistemų valdymas ir kokia svarbi jų funkcija. Pabandykime išvardinti dar dešimt modifikacijų – acetilinimas, oksidacija, glutationilinimas, acilinimas, ADP-ribozilinimas, ubikvitilinimas, O- ir N-glikozilinimas, nitrozilinimas, deamidinimas. Kaip matome 1 pav. vienas baltymas gali būti modifikuotas vienu metu keliais šių būdu, taigi ląstelėje yra vieno baltymo subpopuliacijos, kurių masė ir krūvis skiriasi, t.y. skirstant elektroforezės būdu vienas baltymas gali sudaryti atitinkamai daugybę dėmių.  

PTM nustatymo problemos

l  Mažas santykinis modifikuotų baltymų kiekis, lyginant su nemodifikuotais;

l  Būtina išskirti visus modifikaciją turinčius peptidus, nes galimos ne vienos vietos modifikacijos;

l  PTM yra laikinos ir grįžtamos, todėl būtina inaktyvinti jas šalinančius fermentus; 

l  PTM nėra stabilios, jų gali nelikti tyrimo metu.

 

1 pav. Baltymų posttransliacinių modifikacijų įtaka baltymų funkcijoms ląstelėje

 

 

 

Baltymų fosforilinimas

Baltymų fosforilinimas laikomas vienu iš labai svarbių reguliacinių mechanizmų. Grįžtama katalitinio fermentų pajėgumo moduliacija vyksta kovalentinės modifikacijos būdu. žr. NelsonCoxp.234 Žinduoliams būdingas fermentų fosforilinimas, o bakterijoms - nukleotido prijungimas (2 pav.).

Fermentai, kurių aktyvumas keičiamas grįžtamos kovalentinės modifikacijos būdu, vadinami ,,interconvertable" - tarpusavyje kaitomi. Jie egzistuoja dviejose formose - žemo ir aukšto aktyvumo. Modifikacijos metu vyksta vienos formos perėjimas į kitą. Kai kurių fermentų aktyvi forma fosforilinta, kitų - atvirkščiai.

 

Fermentai, aktyvūs Pi būsenoje

Fermentai, aktyvūs dePi būsenoje

Glikogenfosforilazė

citratliazė

PDH-kinazės

fosforilazės b kinazė

HMG-CoA reduktazė

glikogensintetazė

acetilCoA karboksilazė

HMG reduktazė

Piruvato dehidrogenazė

 

 

Fosforilinimas:

Adenilinimas:

Adenil-ribozilinimas:

2 pav. Pagrindiniai kovalentinės baltymų modifikacijos būdai.

 

Fermentai, fosforilinantys baltymus, vadinami proteinkinazėmis. Jos perneša galinę ATP Pi grupę ant Ser, Thre ar Tyr grupių baltymuose-substratuose. Dažniausiai fosforilinamos specifinės baltymų Ser ar Tyr liekanos (nuo 1 iki 3) iš daugelio:

                3 pav. Baltymų fosforilinimą katalizuoja baltymų kinazės.

 

Nuo cAMP priklausanti proteinkinazė vadinama proteinkinaze A. Kita hormonų poveikį reguliuojančių fermentų klasė yra fosfoproteinfosfatazės (PPP). Jos atlieka fosforilintų baltymų defosforilinimo reakcijas (4 pav.).

4 pav. Baltymų kinazės ir fosfatazės katalizuoja baltymų fosforilinimo–defosforilinimo ciklus

 

Konvertuojantys fermentai - PK ir PPP kai kuriais atvejais patys yra konvertuojami (ypač kinazės) ir griežtai reguliuojami.

cAMP poveikio metabolizmui mechanizmas labai skiriasi pro- ir eukariotuose - prokariotų ląstelėse jis sudaro kompleksą su cAMP+CAP (catabolite activated protein) ir taip aktyvuoja transkripciją (keičia fermentų kiekį) , o eukariotų - cAMP stimuliuoja PK, taip sukeldamas specifinį baltymų fosforilinimą ir aktyvumo pokyčius (bet nekeičia kiekio).

Proteinkinazė A (PKA) yra nuo c-AMP priklausoma proteinkinazė. PKA tetrameras  sudarytas iš 2 reguliacinių R subvienetų ir 2 katalitinių C subvienetų. Tokiame pavidale R2C2 PKA yra  neaktyvi (5 pav.). Jos surišimas su c-AMP kooperatyvus:

5 pav. Proteinkinazės A valdymo mechanizmas

 

4 c-AMP + R2C2 « R2-4 c-AMP + 2C (aktyvi forma)

 

Aktyvi forma katalizuoja nuo Mg2+ priklausomą baltymų sekų -Arg-Arg-X-Ser irLys-Arg-X-X-Ser- fosforilinimą.

Visos nuo antrinių signalo tarpininkų priklausomas PK slopina peptidinis fragmentas (kai citoplazmoje nėra atinkamo signalo tarpininko). Tai gali būti R subvieneto dalis arba reguliacinis pačios PK domenas, kurių pašalinimas (proteoliziniu būdu ar prisijungus signalo tarpininkui) sukelia PK aktyvinimą. Reguliacinės sekos vadinamos pseudosubstratais, nes jos labai panašios į sekas tų fermentų, kuriuos PK fosforilina, tačiau jose nėra fosforilinamų Ser ar Tre liekanų. Šiuo metu žinoma labai daug PK - apie 20 rūšių. PKA yra dvi izoformosPKA I ir PKA II - jų C substratas tas pats, o R - skirtingi. Abi yra visuose audiniuose įvairiu santykiu, gali būti, kad jos veikia skirtingų hormonų atveju. Kt. PK - p5,C, kurių kiti antriniai mesendžeriai.

 

Baltymų fosforilinimo ir defosforilinimo nuoseklios sekos vadinamos fosforilinimo kaskadomis.

Vienas iš labai svarbių fosforilinimu reguliuojamu fermentų yra piruvato dehidrogenazė. Šis kompleksas egzistuoja dviejose formose - a) aktyvioje, defosforilintoje ir b) neaktyviooje, fosforilintoje (6 pav.). Komplekso inaktyvaciją katalizuoja Mg2+-ATP priklausoma proteinkinazė, tvirtai surišta su fermento kompleksu. Ji fosforilina trys Ser grupes PDH a subvienete, tačiau komplekso aktyvumą lemia tik viena iš šių Ser grupių. Reaktyvaciją katalizuoja PPP, kurios aktyvumas priklauso nuo Mg2+ ir nuo Ca2+. PDH konvertuojančios PK ir PPP nuo cAMP nepriklauso. PDH produktai - acetil-KoA ir NADH inhibuoja aktyvią defosfoformą, tačiau stimuliuoja proteinkinazę, taip sukeldami papildomą inaktyvaciją. Laisvas KoA-SH ir NAD+, o taip pat piruvatas inhibuoja proteinkinazę, todėl esant didesnėms šių medžiagų koncentracijoms, kompleksas maksimaliai aktyvus.

6 pav. Piruvato dehidrogenazės regulacijos schema.

Glikogeno sintazė ir glikogeno fosforilazė yra reguliaciniai glikogeno sintezės ir degradacijos fermentai, abu jie be reguliacijos alosteriniais moduliatoriais, dar pasižymi reguliacija kovalentinės modifikacijos būdu.

Glikogenolizės kaskada. Glikogeno forforilazė alosteriškai aktyvuojama AMP ir inhibuojama gliukozės ir ATP. Fermentas egzistuoja dviejose formose - aktyvioje fosforilintoje a ir neaktyvioje defosforilintoje b (7 pav.). Perėjimus tarp šių formų katalizuoja fosforilazės kinazė ir PPP. Fosforilazės kinazė pati yra reguliuojama fosforilinimu-defosforilinimu, katalizuojamu proteinkinazės A ir PPP. Aktyvi fosforilazės kinazės forma a yra fosforilinta, neaktyvi b - defosforilinta. Proteinkinazė A (cAMP) veikia glikogenfosforilazės aktyvumą tik per fosforilazės kinazės fosforilinimą ir aktyvaciją. Forforilazės kinazė yra didelis kompleksas (1300 kDa) sudarytas iš keturių skirtingų subvienetų: a4b4g4d4. Katalitiniai centrai yra g subvienete, likę trys yra reguliaciniai. a  ir b yra fosforilinami pereinant iš neaktyvios formos į aktyvią, o d subvienetas yra reguliacinis baltymas kalmodulinas, surišantis Ca2+. Tokiu būdu šis fermentas (a ir b formos) aktyvuojamas Ca2+, taip sukeliant glikogenfosforilazės fosforilinimą ir aktyvaciją. Todėl cAMP ir Ca2+ kartu užtikrina maksimalų glikogenolizės aktyvumą. Iš kitos pusės, glikogenfosforilazės aktyvaciją galima psiekti, inhibuojant PPP (inhibuoja cAMP). PPP ir fosforilazės kinazė reguliuojamos reciprokiškai, t.y., sąlygos, kuriose viena iš jų stimuliuojama, kita - inhibuojama, taip sustiprinant kaskados veikimo efektyvumą.

7 pav. Glikogenolizės reguliacijos schema.

 

Gliukagonas ir epinefrinas, hormonai, kurie sukelia cAMP koncentracijos ląstelėje padidėjimą, sukelia glikogenolizės aktyvaciją per cAMP (ir PK A) aktyvuodami fosforilazės kinazę ir inhibuodami PPP. Kaskada leidžia labai daug sustiprinti mažą pradinį hormono signalą. 10-10 M epinefrino sukelia 50% gliukozės koncentracijos padidėjimą kraujyje. Insulinas turi priešingą poveikį, nes veikdamas per antrinį mesendžerį ar kinazes jis aktyvuoja PPP.

Glikogensintazė reguliuojama daugelio efektorių taip, kad jos aktyvacija vyksta sąlygomis, kuomet glikogenfosforilazė inaktyvuojama (reciprokinė moduliacija). (Mechanizmas - Devlin, p. 324). Sintazės aktyvi forma a yra defosforilinta, o b - neaktyvi ir fosforilinta. taigi, cAMP aktyvuojama PKA sukelia sintazės konversiją į neaktyvią formą, o glikogenfosforilazės - į aktyvią.Priešingai sintazės ir fosforilazės aktyvumaus veikia ir Ca2+ - kaip minėta aukščiau, fosforilazės kinazė tiesiogiai aktyvuojama Ca2+ per subvienetą d (kalmodulinas); tuo tarpu glikogensintazė yra fosforilinama (inaktyvuojama) dviejų nuo Ca2+ priklausančių kinazių - proteinkinazės C (jai būtinas diacilglicerolis, Ca2+ ir fosfolipidai) ir nuo kalmodulino priklausančios proteinkinazės, o taip pat glikogensintazės kinazės 3, kazeinkinazės I ir kazeinkinazės II (šios kinazės nepriklauso nuo cAMP ir Ca2+). Nei viena iš šių proteinkinazių nefosforilina glikogenfosforilazės.

Fosfoproteinfosfatazių reguliacija. Kurį laiką vyravo nuomonė, jog PPP yra konstitutiškai aktyvūs fermentai. Šiuo metu jau žinoma, kad jų aktyvumas ląstelėje yra reguliuojamas, ir šių procesų svarba bei sudėtingumas nemažesnis, nei PK reguliacijos. PPP yra reguliuojamos posttranskripcine modifikacija - fosforilinimu - defosforilinimu, metilinimu; veikiant antriniams signalo tarpininkams (Ca2+/kalmodulinu, cAMP); sąveika su reguliaciniais baltymais ir baltymais-slopikliais. Šiuo metu yra žinoma virš dešimties PPP, specifiškai pašalinančių fosfato grupes nuo fosforilintų baltymų serino grupių. Dažiausiai PPP aktyvumu pasižymintys katalitiniai subvienetai susiję su įvairiais reguliaciniais subvienetais, kurie gali lemti kokius substratus PPP suriša ir defosforilina, t.y., jie svarbūs nustatant PPP taikiniuis. Vienas iš tokių subvienetų yra taip vadinamas G-subvienetas, kuris lemia PPP susirišimą su glikogenu, nes gerai rišasi ir su glikogenu ir su PPP katalitiniu subvienetu (8 pav.).

8 pav. Glikogenolizės valdymas fosforilinimo būdu

 

Toks surišimas su glikogenu apie 10 kartų padidina PPP aktyvumą glikogenfosforilazės ir glikogensintazės atžvilgiu ir žymiai pagreitina jų defosforilinimą. Tačiau jeigu G subvienetą fosforilina PKA, jo giminingumas PPP labai sumažėja. Atsipalaidavęs katalitinis subvienetas citoplazmoje gali sąveikauti su kitu reguliaciniu baltymu- inhibitoriumi-1,  dėl to PPP aktyvumas dar labiau sumažėja. Baltymo-inhibitoriaus-1 susirišimas su PPP aktyvumas labai padidėja, kai PKA fosforilina šį baltymą. Taigi, PPP aktyvumą netiesiogiai fosforilinimo būdu veikia cAMP (per PKA). Insulino poveikis priešingas cAMP- jis aktyvuoja PPP.

 


Naturales Scientiae Omnibus